İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu
Summary
İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.
Abstract
Myastenia gravis (MG) gibi birçok nöromüsküler hastalık, hayvanlar ve insanlar arasındaki fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinde karakterize edilmesi zor olan nöromüsküler kavşağın (NMJ) işlev bozukluğu ile ilişkilidir. Doku mühendisliği, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ’lerinin in vitro modellerini sağlama fırsatları sunar. Optogenetik proteinleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC’ler) dahil ederek, ışığın belirli dalga boylarıyla uyarılabilen nöronlar ürettik. NMJ sağlıklı ve işlevsel ise, motonörondan gelen nörokimyasal bir sinyal kas kasılmasıyla sonuçlanır. Optogenetik ve mikrofabrikasyonun doku mühendisliği ile entegrasyonu sayesinde, video analizi kullanarak NMJ fonksiyonunu karakterize etmek için tarafsız ve otomatik bir metodoloji oluşturduk. NMJ oluşumu, eşzamanlı video kaydı ile optik stimülasyon ve doku kontraktilitesinin video analizi için standartlaştırılmış bir protokol geliştirilmiştir. İskelet kası kasılmalarını indüklemek için optogenetik motonöronların ışıkla uyarılması, insan NMJ fizyolojisini özetler ve zaman içinde ve çeşitli girdilere yanıt olarak NMJ’nin tekrarlanan fonksiyonel ölçümlerine izin verir. Bu platformun zaman içinde nöromüsküler bağlantıda fonksiyonel iyileşmeler gösterme yeteneğini gösteriyoruz ve hasta MG antikorlarının veya nörotoksinlerin NMJ fonksiyonu üzerindeki zararlı etkilerini karakterize ediyoruz.
Introduction
Nöromüsküler kavşak (NMJ), kas kasılmasına izin veren motonöronlar (MN’ler) ve iskelet kası hücreleri (SkM) arasındaki kimyasal sinapstır. Nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) gibi toksinler veya myastenia gravis (MG) gibi nöromüsküler hastalıklar (NMD) NMJ’nin dejenerasyonuna ve kas kontrolünde azalmaya neden olabilir1. Biyomühendislik ürünü insan doku modelleri, insan NMJ’lerinin fonksiyonel ve fizyolojik mekanizmalarını daha iyi özetler ve hayvan modellerinden daha fazla translasyonel potansiyel sunar.
Hayvan modelleri, NMJ’nin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasını ilerletirken, insan ve hayvan sinapsları arasında, sonuçların insanlara çevirisini sınırlayan ve NMJ’nin in vivo karakterizasyonunuzorlaştıran önemli farklılıklar vardır. 2,3,4. Fareler, insan NMJ’leri4 ile karşılaştırıldığında daha büyük NMJ’lere ve daha küçük aktif bölge yoğunluklarına sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde yapılan ilaç çalışmaları her zaman insan klinik çalışmalarında bulunan etkileri yansıtmamaktadır. Tasarlanmış insan doku modelleri, NMJ’nin sağlıklı gelişimini ve nöromüsküler hastalıkların patolojisini inceleme fırsatı sunar ve ilaç taramalarına izin verir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC’ler)5, iskelet kası hücreleri6,7 ve motonöronlar 8,9 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayrılabilir. hiPSC’ler hasta hücrelerinden kolayca üretilebilir, bu da hastaya özgü doku modelleri aracılığıyla daha iyi hastalıkmodellemesi 10 ve ilaç taraması 11,12 sağlar.
SkM’lerin ve MN’lerin iki boyutlu (2B) tek katmanlı ortak kültürleri, fizyolojik NMJ’lerin morfolojisi, fenotipi, organizasyonu ve fonksiyonel davranışından yoksundur. NMJ’ler, analiz için motor birimlerin izolasyonunu engelleyen, doğru fonksiyonel ölçümleri sınırlayan ve tekrarlanan, sistematik deneyler için kullanımlarını önleyen 2D kültürde rastgeleoluşur13 . NMJ’lerin üç boyutlu (3D) doku modelleri, fizyolojik NMJ’lerin 7,14,15,16,17’nin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini özetleyerek bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelir. Bu modeli kullanarak, iki doku tipi ayrı ayrı geliştirilir ve daha sonra aksonal büyümeyi yönlendirerek entegre edilir ve 2D kültür sistemlerine kıyasla daha organize NMJ’lerin gelişmesine izin verilir.
Önceki çalışmamız, optogenetiğin doku mühendisliği ile birleştirilmesinin doğru non-invaziv stimülasyona ve NMJ fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verebileceğini göstermiştir18,19. Genetik mühendisliği sayesinde, ışığa duyarlı proteinler hiPSC’lerin genomuna entegre edilebilir. Mavi ışığa tepki olarak açılan bir iyon kanalı olan channelrhodopsin-2’yi (ChR2), nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin zarına entegre etmek, hücre aktivasyonu20,21,22 üzerinde temassız mekansal zamansal kontrol sağlar. ChR2 taşıyan hiPSC’ler, mavi ışığa duyarlı optogenetik motonöronlara ayrılabilir, nöronları uyaran tipik invaziv elektrotlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve kas hücrelerinin elektrotlar tarafından istenmeyen şekilde uyarılmasını önler23. Bu sistem, optogenetik olmayan iskelet kası hücrelerinde kasılmaları uyarmak için optogenetik motonöronları kullanır. Video yakalama ve kontrollü mavi ışık aydınlatmasını birleştirmek, ko-kültürlü dokuların aynı anda uyarılmasını ve NMJ işlevi için kaydedilmesini sağlar.
MG, nikotinik asetilkolin reseptörlerini (AChR) hedef alan otoantikorlardan kaynaklanır ve bu da NMJ fonksiyonunun azalmasına ve kas güçsüzlüğüne neden olur24. Sunulan semptomlara, elektro tanıya ve serolojik kan testleri ile otoantikorların saptanmasına dayanarak teşhis edilir. Bununla birlikte, MG’de rol oynayan tüm otoantikorlar tanımlanmamıştır ve bazı seronegatif hastalara MG tanısı konmuştur, ancak tanınmış antikorları yoktur25,26. Sistemimiz, MG hastalarından serum eklenmesinden önce ve sonra NMJ’nin tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmesine izin vererek, MG antikorlarının neden olduğu fonksiyonel ve biyokimyasal değişiklikler hakkında paha biçilmez bir fikir verir18. Protokolümüz, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ’nin 3D in vitro modellerinin nasıl üretileceğini göstermektedir. Sistemin çok yönlülüğünü iki platformda, bir mikroakışkan cihazda ve daha büyük bir açık kuyulu biyoreaktör platformunda gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu sistem, NMJ fonksiyonunun otomatik ve tarafsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için optogenetik ve video işlemeyi birleştiren tasarlanmış bir 3D insan dokusu modelidir. Standartlaştırılmış bir protokol kullanarak, fizyolojik gelişim sırasında NMJ fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme ve nörotoksin maruziyeti ve myastenia gravis hasta serumları gibi patolojilerin zararlı etkilerini karakterize etme yeteneğini gösterdik.
Önceki çalışmalar, MG hastası ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH [hibe numaraları EB025765 ve EB027062], DOD [ödül numarası W81XWH-18-1-0095] ve UCSF Mühendislik Yoluyla Sağlık İnovasyonu (HIVE Bursu) tarafından sağlanan finansman desteğini minnetle kabul ediyoruz. Columbia Üniversitesi Kök Hücre Çekirdeğine, hücre yeniden programlamadaki yardımları ve rehberlikleri için minnetle teşekkür ederiz.
Materials
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media and Supplements | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
| 37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| 546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| 573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
| 594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| 594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Growth Factors | |||
| Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
| Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
| Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| Antibodies | |||
| α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipment | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
| Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| NIS elements | Nikon | Basic Research | |
| Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |
References
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
- Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
- Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
- Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
- Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
- Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
- Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
- Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
- Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).
