हम मानव इंजीनियर कंकाल की मांसपेशी ऊतक और ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स का उपयोग करके न्यूरोमस्कुलर जंक्शन फ़ंक्शन की विशेषता के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्वचालित और निष्पक्ष इमेजिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं। यह प्रणाली समय के साथ न्यूरोमस्कुलर कनेक्टिविटी के कार्यात्मक परिमाणीकरण की अनुमति देती है और न्यूरोटॉक्सिन और मायस्थेनिया ग्रेविस रोगी सीरम के कारण कम न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन का पता लगाती है।
कई न्यूरोमस्कुलर रोग, जैसे कि मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी), न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) की शिथिलता से जुड़े होते हैं, जो जानवरों और मनुष्यों के बीच शारीरिक अंतर के कारण पशु मॉडल में चिह्नित करना मुश्किल है। ऊतक इंजीनियरिंग कार्यात्मक मानव एनएमजे के इन विट्रो मॉडल प्रदान करने के अवसर प्रदान करता है जिसका उपयोग एनएमजे विकृतियों का निदान और जांच करने और संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) में शामिल करके, हमने न्यूरॉन्स उत्पन्न किए जिन्हें प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजित किया जा सकता है। यदि एनएमजे स्वस्थ और कार्यात्मक है, तो मोटोन्यूरॉन से एक न्यूरोकेमिकल सिग्नल के परिणामस्वरूप मांसपेशियों का संकुचन होता है। ऊतक इंजीनियरिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन के एकीकरण के माध्यम से, हमने वीडियो विश्लेषण का उपयोग करके एनएमजे फ़ंक्शन की विशेषता के लिए एक निष्पक्ष और स्वचालित पद्धति स्थापित की। एनएमजे गठन, एक साथ वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ ऑप्टिकल उत्तेजना, और ऊतक संकुचन के वीडियो विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। कंकाल की मांसपेशियों के संकुचन को प्रेरित करने के लिए प्रकाश द्वारा ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स की उत्तेजना मानव एनएमजे शरीर विज्ञान को दोहराती है और समय के साथ और विभिन्न इनपुट के जवाब में एनएमजे के दोहराए गए कार्यात्मक माप की अनुमति देती है। हम समय के साथ न्यूरोमस्कुलर कनेक्टिविटी में कार्यात्मक सुधार दिखाने के लिए इस मंच की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं और एनएमजे फ़ंक्शन पर रोगी एमजी एंटीबॉडी या न्यूरोटॉक्सिन के हानिकारक प्रभावों को चिह्नित करते हैं।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) मोटोन्यूरॉन्स (एमएन) और कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसकेएम) के बीच रासायनिक सिनैप्स है जो मांसपेशियों के संकुचन की अनुमति देता है। विषाक्त पदार्थ, जैसे न्यूरोटॉक्सिन α-बंगारोटॉक्सिन (बीटीएक्स), या मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी) जैसे न्यूरोमस्कुलर रोग (एनएमडी) एनएमजे के अध: पतन और मांसपेशियों के नियंत्रण में कमी का कारण बन सकते हैं1. बायोइंजीनियर्ड मानव ऊतक मॉडल मानव एनएमजे के कार्यात्मक और शारीरिक तंत्र को बेहतर ढंग से दोहराते हैं और पशु मॉडल की तुलना में अधिक ट्रांसलेशनल क्षमता प्रदान करते हैं।
जबकि पशु मॉडल ने एनएमजे के गठन और कार्य की समझ को उन्नत किया है, मानव और पशु सिनैप्स के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं जो मनुष्यों को परिणामों के अनुवाद को सीमित करते हैं और एनएमजे के विवो लक्षण वर्णन में 2,3,4 को चुनौती देते हैं। अध्ययनों ने माउस और मानव एनएमजे के बीच अलग-अलग शारीरिक अंतर दिखाए हैं। मानव एनएमजेकी तुलना में चूहों में बड़े एनएमजे और छोटे सक्रिय क्षेत्र घनत्व होते हैं। इसके अतिरिक्त, पशु मॉडल में किए गए दवा अध्ययन हमेशा मानव नैदानिक परीक्षणों में पाए जाने वाले प्रभावों को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इंजीनियर मानव ऊतक मॉडल एनएमजे के स्वस्थ विकास और न्यूरोमस्कुलर रोगों की विकृति का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग की अनुमति देने का अवसर प्रदान करते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 5 को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है, जिसमें कंकाल की मांसपेशी कोशिकाएं 6,7 और मोटोन्यूरॉन्स 8,9 शामिल हैं। एचआईपीएससी को रोगी कोशिकाओं से आसानी से उत्पन्न किया जा सकता है, जिससे रोगी-विशिष्ट ऊतक मॉडल के माध्यम से बेहतर रोग मॉडलिंग10 और ड्रग स्क्रीनिंग 11,12 की अनुमति मिलती है।
एसकेएम और एमएन की द्वि-आयामी (2 डी) मोनोलेयर सह-संस्कृतियों में शारीरिक एनएमजे की आकृति विज्ञान, फेनोटाइप, संगठन और कार्यात्मक व्यवहार की कमी होती है एनएमजे बेतरतीब ढंग से 2 डी संस्कृति में बनते हैं, जो विश्लेषण के लिए मोटर इकाइयों के अलगाव को रोकता है, सटीक कार्यात्मक माप को सीमित करता है, और दोहराया, व्यवस्थित प्रयोगों के लिए उनके उपयोग को रोकताहै 13 . एनएमजे के त्रि-आयामी (3 डी) ऊतक मॉडल इन सीमाओं में से कई को दूर करते हैं, शारीरिक एनएमजे 7,14,15,16,17 की रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को दोहराते हैं। इस मॉडल का उपयोग करते हुए, दो ऊतक प्रकारों को अलग-अलग विकसित किया जाता है और फिर अक्षतंतु विकास को निर्देशित करके एकीकृत किया जाता है, जिससे 2 डी संस्कृति प्रणालियों की तुलना में अधिक संगठित एनएमजे विकसित हो सकते हैं।
हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि ऊतक इंजीनियरिंग के साथ ऑप्टोजेनेटिक्स के संयोजन से एनएमजे फ़ंक्शन18,19 के सटीक गैर-इनवेसिव उत्तेजना और मूल्यांकन की अनुमति मिल सकती है। जेनेटिक इंजीनियरिंग के माध्यम से, प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन को एचआईपीएससी के जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है। चैनलरोडोप्सिन -2 (सीएचआर 2) को एकीकृत करना, एक आयन चैनल जो नीली रोशनी के जवाब में खुलता है, न्यूरॉन्स जैसे उत्तेजक कोशिकाओं की झिल्ली में सेल सक्रियण20,21,22 पर गैर-संपर्क स्थानिक नियंत्रण की अनुमति देता है। सीएचआर 2 ले जाने वाले एचआईपीएससी को नीली रोशनी के प्रति संवेदनशील ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है, विशिष्ट इनवेसिव इलेक्ट्रोड की आवश्यकता को दूर करता है जो न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है और इलेक्ट्रोड23 द्वारा मांसपेशियों की कोशिकाओं की अवांछित उत्तेजना से बचता है। यह प्रणाली गैर-ऑप्टोजेनेटिक कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं में संकुचन को उत्तेजित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक मोटोन्यूरॉन्स का उपयोग करती है। वीडियो अधिग्रहण और नियंत्रित नीली रोशनी रोशनी के संयोजन से सह-सुसंस्कृत ऊतकों को एनएमजे फ़ंक्शन के लिए एक साथ उत्तेजित और रिकॉर्ड किया जा सकता है।
एमजी निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) को लक्षित करने वाले ऑटोएंटिबॉडी के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप एनएमजे फ़ंक्शन और मांसपेशियों की कमजोरी कम हो जातीहै 24. इसका निदान प्रस्तुत लक्षणों, इलेक्ट्रोडायग्नोसिस और सीरोलॉजिकल रक्त परीक्षणों के माध्यम से ऑटोएंटिबॉडी का पता लगाने के आधार पर किया जाता है। हालांकि, एमजी में शामिल सभी ऑटोएंटिबॉडी की पहचान नहीं की गई है, और कुछ सीरोनिगेटिव रोगियों को एमजी का निदान किया जाता है लेकिन कोई मान्यता प्राप्त एंटीबॉडी25,26 नहीं है। हमारी प्रणाली एमजी रोगियों से सीरम के अलावा एनएमजे के बार-बार कार्यात्मक मूल्यांकन की अनुमति देती है, जो एमजी एंटीबॉडी18 के कारण कार्यात्मक और जैव रासायनिक परिवर्तनों में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। हमारा प्रोटोकॉल दिखाता है कि कार्यात्मक मानव एनएमजे के इन विट्रो मॉडल में 3 डी का उत्पादन कैसे किया जाए जिसका उपयोग एनएमजे विकृतियों का निदान और जांच करने और संभावित चिकित्सीय परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हम दो प्लेटफार्मों, एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस और एक बड़े ओपन-वेल बायोरिएक्टर प्लेटफॉर्म में सिस्टम की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करते हैं।
यह प्रणाली एक इंजीनियर 3 डी मानव ऊतक मॉडल है जो एनएमजे फ़ंक्शन के स्वचालित और निष्पक्ष मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और वीडियो प्रोसेसिंग को जोड़ती है। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग ?…
The authors have nothing to disclose.
हम कृतज्ञतापूर्वक एनआईएच [अनुदान संख्या ईबी 025765 और ईबी 027062], डीओडी [पुरस्कार संख्या डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच -18-1-0095], और इंजीनियरिंग (हाइव फैलोशिप) के माध्यम से यूसीएसएफ हेल्थ इनोवेशन द्वारा वित्त पोषण समर्थन को स्वीकार करते हैं। हम सेल रिप्रोग्रामिंग के साथ उनकी मदद और मार्गदर्शन के लिए कोलंबिया विश्वविद्यालय स्टेम सेल कोर को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
Cells | |||
SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
Media and Supplements | |||
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
Bovine Serum Albumin solution | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
G-5 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
Insulin, Recombinant Human | Millipore Sigma | 91077C-100MG | |
Matrigel | Corning | 354277 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
MyoTonic Growth Media Kit | Cook Myosite | MK-4444 | |
N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
NBactiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
Neurobasal-A Medium | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
Plasticware | |||
30 mm cage cube system | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4 | |
37 µm Reversible Strainer, large | Stem Cell Technologies | 27250 | |
546 nm short-pass excitation filter | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
573 nm dichroic mirror | Semrock | FF573-Di01–25×36 | |
594 nm long- pass emission filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
594 nm long-pass excitation filter | Semrock | BLP01-594R-25 | |
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic – Integrated Legs | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
Heat sink | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
Optics | |||
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50400-03 | |
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile | PluriSelect | 43-50500-03 | |
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base – 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
ring-actuated iris diaphragm | ThorLabs | SM1D12D | |
T-Cube LED drivers | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
Molds | |||
Female Threaded Hex Standoffs, 3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
Low-Profile C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
Growth Factors | |||
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate | Millipore Sigma | A9501-1G | |
CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
DAPT 10 mg | R&D Systems | 2634/10 | |
Human CNTF, research grade, 5 µg | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
Human Vitronectin Protein, CF | R&D Systems | 2349-VN-100 | |
IGF1 Recombinant Human Protein | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
Laminin mouse protein, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Recombinant Human Agrin Protein | R&D Systems | 6624-AG-050 | |
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug | R&D Systems | 212-GD-050/CF | |
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
Recombinant Human Neurotrophin-4 | Cell Sciences | CRN501B | |
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus | R&D Systems | 1845-SH-100 | |
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
Retinoic Acid, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
SAG Smoothened Agonist | Millipore Sigma | 566660 | |
SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
Vitronectin from human plasma | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
Antibodies | |||
α-actinin mAb (Mouse IgG1) | Abcam | ab9465 | |
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat) | Millipore | AB144P | |
Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
Equipment | |||
Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
Automated stage | Applied scientific instrumentation | MS- 2000 XYZ | |
Expanded plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 (115V) | |
Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX-ILL100LH | |
Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
Zyla 4.2 sCOMS Camera | Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
Software | |||
Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
Mastercam | Mastercam | Mastercam for Solidworks | |
Matlab | Matlab | R2021b | |
NIS elements | Nikon | Basic Research | |
Solidworks 3D CAD | Solidworks | Solidworks Standard |