Methodenartikel

Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

DOI:

10.3791/63761

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10. Mai 2022

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.

Zusammenfassung

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Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt als entscheidender Risikofaktor für das hepatozelluläre Karzinom. Die derzeitige Behandlung kann nur die Viruslast verringern, aber nicht zu einer vollständigen Remission führen. Ein effizientes Hepatozytenmodell für HBV-Infektionen würde einen lebensechten viralen Lebenszyklus bieten, der für das Screening von Therapeutika entscheidend wäre. Die meisten verfügbaren Anti-HBV-Wirkstoffe zielen auf Lebenszyklusphasen nach dem viralen Eintritt ab, aber nicht vor dem Viruseintritt. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines kompetenten Hepatozytenmodells, das in der Lage ist, nach Therapeutika zu suchen, die auf prävirale und postvirale Eintrittsphasen abzielen. Dies umfasst das Targeting der Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid-Bindung (NTCP), die cccDNA-Bildung, die Transkription und die virale Assemblierung basierend auf imHC oder HepaRG als Wirtszellen. Hier verwendete der HBV-Eintrittshemmungsassay Curcumin, um HBV-Bindungs- und Transportfunktionen über NTCP zu hemmen. Die Inhibitoren wurden auf Bindungsaffinität (KD) mit NTCP unter Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) - einem universellen Werkzeug für das HBV-Arzneimittelscreening basierend auf thermodynamischen Parametern - untersucht.

Einleitung

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Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt weltweit als lebensbedrohliche Krankheit. Eine chronische HBV-Infektion birgt ein Risiko für Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom1. Die derzeitige Anti-HBV-Behandlung konzentriert sich hauptsächlich auf den postviralen Eintritt unter Verwendung von Nukleos(t)ide-Analoga (NAs) und Interferon-alpha (IFN-α)2,3. Die Entdeckung eines HBV-Eintrittsinhibitors, Myrcludex B, hat ein neues Ziel für Anti-HBV-Wirkstoffe identifiziert4. Die Kombination von Eintrittsinhibitoren und NAs bei chronischem HBV hat die Viruslast im Vergleich zu denen, die nur auf die Virusreplikation abzielen, signifikant verringert 5,6. Das klassische Hepatozytenmodell für das Screening von HBV-Eintrittsinhibitoren ist jedoch durch niedrige virale Rezeptorspiegel (Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid, NTCP) begrenzt. Die Überexpression von hNTCP in Hepatomzellen (d.h. HepG2 und Huh7) verbessert die HBV-Infektiosität 7,8. Dennoch exprimieren diese Zelllinien geringe Mengen an medikamentenmetabolisierenden Enzymen der Phasen I und II und weisen eine genetische Instabilität auf9. Hepatozytenmodelle, die helfen können, verschiedene Mechanismen von Anti-HBV-Kandidatenverbindungen wie präviralen Eintrag, NTCP-Bindung und viralen Eintritt anzusprechen, würden die Identifizierung und Entwicklung wirksamer Kombinationsschemata beschleunigen. Die Studie zur Anti-HBV-Aktivität von Curcumin hat die Hemmung des Viruseintritts als neuen Mechanismus zusätzlich zur postviralen Eintrittsunterbrechung aufgeklärt. Dieses Protokoll beschreibt ein Wirtsmodell für das Screening von Anti-HBV-Eintrittsmolekülen10.

Das Ziel dieser Methode ist es, mögliche Anti-HBV-Verbindungen für die Hemmung des Viruseintritts zu erforschen, insbesondere die Blockierung der NTCP-Bindung und des NTCP-Transports. Da die NTCP-Expression ein kritischer Faktor für den HBV-Eintritt und die Infektion ist, haben wir das Hepatozyten-Reifungsprotokoll optimiert, um die NTCP-Wertezu maximieren 11. Darüber hinaus kann dieses Protokoll die hemmende Wirkung auf den HBV-Eintritt als Hemmung der HBV-Bindung gegenüber Hemmung der Internalisierung unterscheiden. Der Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA) wurde ebenfalls unter Verwendung einer ELISA-basierten Methode anstelle eines Radioisotops modifiziert, um den NTCP-Transport12,13 darzustellen. Die Rezeptor- und Ligandeninteraktion wurde durch ihre 3D-Strukturenbestätigt 14,15. Die Hemmung der NTCP-Funktion kann durch Messung der TCA-Aufnahmeaktivität16 bewertet werden. Diese Technik lieferte jedoch keinen direkten Nachweis einer NTCP-Bindung an die Kandidaten-Inhibitoren. Daher kann die Bindung mit verschiedenen Techniken untersucht werden, wie z.B. Oberflächenplasmonresonanz 17, ELISA, fluoreszenzbasierter Thermoverschiebungsassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen und verschiedenen anderen Methoden20. Unter diesen Techniken ist ITC ein Zielstandard in der Bindungsanalyse, da es Wärmeabsorption oder -emission in fast jeder Reaktion beobachten kann21. Die Bindungsaffinität (KD) von NTCP und Kandidatenverbindungen wurde direkt mittels ITC bewertet; Diese Affinitätswerte waren genauer als diejenigen, die mit dem In-silico-Vorhersagemodell 22 ermittelt wurden.

Dieses Protokoll behandelt Techniken zur Hepatozytenreifung, HBV-Infektion und zum Screening auf HBV-Eintrittshemmer. Kurz gesagt, ein Hepatozytenmodell wurde basierend auf imHC- und HepaRG-Zelllinien entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden innerhalb von 2 Wochen zu reifen Hepatozyten differenziert. Die Hochregulierung der NTCP-Spiegel wurde mittels real-time PCR, Western Blot und Durchflusszytometrienachgewiesen 11. Hepatitis-B-Virion (HBVcc) wurde produziert und aus HepG2.2.15 gesammelt. Das differenzierte imHC bzw. HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) wurde 2 h vor der Inokulation mit HBV-Virion prophylaktisch mit den Anti-HBV-Kandidaten behandelt. Das erwartete Ergebnis des Experiments war die Identifizierung der Wirkstoffe, die zelluläres HBV und Infektiosität verringern. Die Anti-NTCP-Aktivität wurde mit dem TCA-Aufnahmetest bewertet. Die NTCP-Aktivität konnte von den Agenten unterdrückt werden, die NTCP spezifisch gebunden haben. Die ITC-Technik wurde verwendet, um die Machbarkeit einer interaktiven Bindung zu untersuchen, die Inhibitoren und ihre Zielproteine vorhersagen kann, indem die Bindungsaffinität (KD) des Liganden für den Rezeptor über nicht-kovalente Wechselwirkungen des biomolekularen Komplexesbestimmt wird 23,24. Zum Beispiel steht K D ≥ 1 × 103 mM für schwache Bindung, K D ≥ 1 × 106 μM für moderate Bindung und K D ≤ 1 × 109 nM für starke Bindung. Das ΔG korreliert direkt mit Bindungswechselwirkungen. Insbesondere ist eine Reaktion mit negativem ΔG eine exergonische Reaktion, was darauf hinweist, dass die Bindung ein spontaner Prozess ist. Eine Reaktion mit einem negativen ΔH deutet darauf hin, dass die Bindungsprozesse von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräften abhängen. Sowohl TCA-Aufnahme als auch ITC-Daten könnten verwendet werden, um nach Anti-HBV-Eintragsagenten zu suchen. Die Ergebnisse dieser Protokolle können eine Grundlage nicht nur für das Anti-HBV-Screening bilden, sondern auch für die Interaktion mit NTCP, die durch Bindungsaffinität und Transportfunktion bewertet wird. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung und Charakterisierung von Wirtszellen, das experimentelle Design und die Bewertung des Anti-HBV-Eintritts zusammen mit der NTCP-Bindungsaffinität.

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Protokoll

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HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen in einer Haube für biologische Gefahrenströme der Klasse II oder einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Der Umgang mit HBV wurde vom IRB ethisch genehmigt (MURA2020/1545). Weitere Informationen zu allen Lösungen, Reagenzien, Geräten und Zelllinien, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .

1. Vorbereitung von Wirtszellen (reife Hepatozyten)

  1. Hepatozyten (3,75 × 105 Zellen HepaRG oder imHC) kultivieren und in einem 75 cm2 Kulturkolben mit 10 ml DMEM/F12-Medium aufbewahren, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Warten Sie, bis die Zellen 80% -90% Konfluenz erreicht haben (innerhalb von 1 Woche).
  2. Entsorgen Sie das alte Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  3. Das PBS absaugen und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen.
  4. Inkubieren Sie den Kolben im 37 °C Inkubator für 2-3 min und überprüfen Sie die anhaftenden Zellen mit einem inversen Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse. Stellen Sie sicher, dass sich die Monoschicht von der Kulturoberfläche gelöst hat.
  5. Hemmen Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml des Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS, in den Kolben geben und die entnommenen Zellen vorsichtig resuspendieren. Die Zellsuspension in ein 15-ml-konisches Röhrchen geben und 3 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
  6. Saugen Sie den Überstand aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie mit 1-2 ml des vorgewärmten Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.
  7. Mischen Sie jeweils 10 μL der Zellsuspension und Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit höher als 90% ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  8. Samen Sie 1 × 10 6 Zellen pro 2 ml in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte und halten Sie das vollständige DME/F12-Medium aufrecht, bis die Zellen 100% Konfluenz erreichen.
  9. Für die hepatische Reifung bereiten Sie das hepatische Reifungsmedium vor (Williams-E-Medium, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 5 μg/ml Insulin, 50 μM Hydrocortison, 2 mM L-Glutamin und 2% DMSO).
  10. Ersetzen Sie das Kulturmedium 2x pro Woche.
  11. Halten Sie die Hepatozyten 2 Wochen lang im Reifungsmedium, um reife Hepatozyten zu erhalten, die für eine HBV-Infektion bereit sind.

2. Quantifizierung des zellulären NTCP

  1. Messung der NTCP-Expression mittels real-time PCR
    1. Sammeln Sie das Pellet reifer Hepatozyten durch Trypsinisierung (siehe Schritte 1.2-1.5).
    2. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus dem Zellpellet mit einem RNA-Extraktionskit mit DNase-I-Behandlung.
    3. Synthetisieren Sie cDNA aus 200 ng Gesamt-RNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und eines Reverse-Transkriptionssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Verdünnen Sie die cDNA auf 50 ng/μL und verwenden Sie sie als Vorlage für die PCR-Reaktion. Mischen Sie 2 μL der verdünnten cDNA mit den PCR-Master-Mix-Reagenzien, die SYBR grüne qRT-PCR-Kit-Lösung enthalten, mit 5 μM NTCP-spezifischen Primern (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' und 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Zur Normalisierung verwenden Sie GAPDH als Housekeeping-Gen mit spezifischen Primern (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' und 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
    6. Amplifizieren Sie die cDNA-Proben mit einem Thermocycler unter folgenden Temperaturbedingungen: 1 Zyklus von 3 min bei 95 °C (anfängliche Denaturierung); 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C (Denaturierung), 30 s bei 60 °C bis 65 °C (Glühen), 30 s bei 72 °C (Verlängerung); 1 Zyklus von 5 min bei 72 °C (Endverlängerung).
    7. Berechnen Sie die NTCP-Faltenänderung in reifen Hepatozyten über undifferenzierten Zellen unter Verwendung von GAPDH als Kalibrorgen basierend auf der 2-ΔΔCT-Methode .
  2. Quantifizierung von NTCP mithilfe der Western-Blot-Analyse
    1. Hepatozyten mit einem Zellschaber ernten und bei 300 x g, 25 °C für 5 min zentrifugieren, um das Zellpellet zu sammeln.
    2. Befolgen Sie die Anweisungen des RIPA-Pufferherstellers, um das zelluläre Protein mit 100 μL RIPA-Puffer zu extrahieren, der 1x Proteaseinhibitor enthält.
    3. Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA) -Methode.
    4. Mischen Sie 12,5 μL Protein mit 2x Ladenfarbstoff im Verhältnis 1:1.
    5. Die Proteinmischung und die Standardleiter bei 95 °C 5 min kochen.
    6. Fügen Sie 1x Laufpuffer in die Elektrophoresekammer ein.
    7. Laden Sie 5 μL der Proteinstandardleiter oder 20 μL der gekochten Proteinmischung in ein 10% (w/v) Polyacrylamidgel.
    8. Durchführung der Gelelektrophorese: 50 V für 30 min, gefolgt von 90 V für 1 h bei Raumtemperatur.
    9. Bereiten Sie eine PVDF-Membran vor, indem Sie sie 30 s lang in Methanol einweichen, mit doppelt destilliertem Wasser für 1-2 min waschen und zusammen mit zwei Stücken Filterpapier im Transferpuffer für 10 min oder bis zum Gebrauch einweichen.
    10. Legen Sie das Filterpapier auf die Anodenplatte einer halbtrockenen Transferzelle; Legen Sie dann die PVDF-Membran, das Gel und das Filterpapier in dieser Reihenfolge darauf.
    11. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die PVDF-Membran bei 10 V für 25 min bei Raumtemperatur.
    12. Blockieren Sie die Membran mit WB-Blocklösung für 1 h bei Raumtemperatur.
    13. Die Membran mit Anti-Natrium-Taurocholat-Cotransport-Polypeptid (Anti-NTCP) (1:100 Verdünnung) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
    14. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST.
    15. Die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:10.000 Verdünnung) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    16. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST und dann 1 x 5 min mit TBS.
    17. Erkennen Sie NTCP mithilfe eines HRP-Substrats (siehe Materialtabelle).
    18. Fügen Sie mindestens 0,1 ml HRP-Substratlösung/cm2 der Membran hinzu und inkubieren Sie die Membran für 3-5 min im Dunkeln.
    19. Visualisieren Sie NTCP mit einem Gel-Dokumentationssystem im Chemilumineszenzmodus, wählen Sie die Markeroption für die Membran, passen Sie die Belichtungszeit im Akkumulationsmodus alle 1 Minute an und nehmen Sie das Foto mit verschiedenen Belichtungszeiten für 5 Minuten auf.
    20. Streifen und sondieren Sie den Blot mit Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (1:200.000 Verdünnung) und HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:10.000 Verdünnung).
  3. Messung des NTCP-Spiegels mittels Durchflusszytometrie
    1. Sammeln Sie die Zellpellets reifer Hepatozyten, indem Sie die Zellen mit 8 mM EDTA für 15 min inkubieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin oder anderen Proteasen, die Zelloberflächenrezeptoren stören können. Da NTCP ein Zelloberflächenrezeptorprotein ist, können Schäden durch Trypsinisierung zu negativen Ergebnissen führen.
    2. Fixieren Sie die Hepatozyten mit 300 μL 3,7% Paraformaldehyd in 1x PBS für 15 min. Die Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugiert.
    3. Die Zellen 2x mit 700 μL oder 1x PBS mit 1% FBS (v/v) waschen, 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, 300 μL 0,05% Triton X-100 in PBS zum Zellpellet geben und die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren, um sie zu permeabilisieren.
    4. 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, Zellpellet 3 x 1 min mit 700 μL PBS mit 1% FBS (v/v) waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper gegen NTCP (1:100 Verdünnung) bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
    5. Färben Sie die Zellen mit sekundären Antikörpern, die an Alexa Fluor 488 konjugiert sind, bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 μL PBS mit 1% FBS (v/v).
    6. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, erwärmen Sie den Laser für 15 Minuten und führen Sie eine routinemäßige Reinigung durch.
    7. Wählen Sie die Messparameter aus, einschließlich Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE), und stellen Sie die automatische Kompensationsanpassung über die Software ein. Fügen Sie die Kompensationskontrollproben hinzu: ungefärbte Kontrolle, FITC-gefärbte Kontrolle und PE-gefärbte Kontrolle.
      HINWEIS: FSC- und SSC-Parameter werden verwendet, um die Größe und Granularität einzelner Zellen zu bestimmen, um die Zellpopulation für die Gating-Analyse auszuwählen. Der Fluoreszenzkanaldetektor verfügt über FITC- und PE-Kanäle. Wählen Sie für dieses Protokoll den FITC-Kanal aus, um Alexa Fluor 488 zu erkennen.
    8. Führen Sie die ungefärbte Probe mit mittlerer fluidischer Flussrate (60 μL/min) durch, passen Sie den Schwellenwert von FSC und SSC an, bis sie die interessierende Zellpopulation abdecken, markieren Sie den Gate-Bereich in diesem Bereich und wenden Sie ihn auf alle Kompensationskontrollen an.
    9. Stellen Sie die Fluoreszenz-Photomultiplierröhre (PMT) mit der ungefärbten Steuerung ein und passen Sie die PMT-Spannung von FITC oder PE im negativen Quadranten an. Führen Sie die positiv gefärbte Probe aus und passen Sie FITC oder PE in der positiven Quadrantenskala an. Führen Sie die Steuerelemente ohne Färbung, FITC-gefärbt oder PE-gefärbt aus, berechnen Sie die Kompensation, und wenden Sie sie auf die Probeneinstellungen an. Führen Sie das Hepatozytenbeispiel aus, um den NTCP-Pegel zu messen.
    10. Analysieren Sie die gefärbten Hepatozyten mit der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle).
      1. Klicken Sie unter BD FACSuite-Fenster auf das Steuerrohr auf der Registerkarte Datenquellen und warten Sie, bis die Rohdaten angezeigt werden.
      2. Klicken Sie auf der Registerkarte Arbeitsblatt auf der rechten Seite auf die Schaltfläche Ellipsentor , wählen Sie mit dem Mauszeiger die Zellpopulation in SSC und das FSC-Punktdiagramm aus und warten Sie, bis der Kreis P1 angezeigt wird.
      3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Intervallgatter und markieren Sie den Bereich im FITC-Histogramm, beginnend mit dem höchsten Fluoreszenzintensitätswert auf der rechten Seite. Beachten Sie die angezeigte Zeile P2.
      4. Klicken Sie auf das Experimentröhrchen und beobachten Sie, dass sich die Daten auf der Registerkarte Arbeitsblatt ändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und dann auf die leere Stelle im Arbeitsblatt. Beobachten Sie die angezeigten statistischen Werte der NTCP-Grundgesamtheit.

3. Herstellung der aus Zellkultur gewonnenen HBV-Partikel (HBVcc)

  1. Kultur HepG2.2.15 in vollständigem Medium (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) in einer 10 cm Petrischale für 24 h.
  2. Ersetzen Sie das komplette Medium, das mit 380 μg / ml Geneticin (G418) ergänzt wurde, wenn die HepG2.2.15 60% -70% Konfluenz erreichen. Ernte das konditionierte Medium alle 2 Tage; lagern Sie das HBV-haltige Medium bei 4 °C.
  3. Zellreste werden durch Zentrifugieren des Überstands bei 5.000 × g, 4 °C für 20 min entfernt. Sammeln Sie das konditionierte Medium mit einer 20-ml-Spritze und filtern Sie es durch einen 0,45 μm proteinarmen Filter, um Zelltrümmer zu entfernen.
  4. Um HBV zu konzentrieren, verdünnen Sie 1 Volumen Konzentrator mit 3 Volumen des gefilterten Überstands aus Schritt 3.3 in einem konischen Zentrifugenröhrchen und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Rohrinversion. Die Mischung 1 h bei 4 °C eintragen. Zentrifugieren Sie die Lösung für 1 h bei 1.500 × g, 4 °C und stellen Sie sicher, dass ein cremefarbenes Pellet sichtbar ist.
    HINWEIS: Fügen Sie für jeweils 30 ml gefilterten Überstand aus Schritt 3.3 10 ml des Konzentrators hinzu, um 40 ml Gesamtvolumen zu erreichen.
  5. Bewerten Sie den HBV-Titer (Genomäquivalent) mit HBV 1,3-mer-WT-Replikon als Standardkurve im Bereich von 1 × 102 bis 1 × 1010 unter Verwendung der absoluten real-time PCR, wie zuvorbeschrieben 11.
  6. Das Pellet vorsichtig in FBS rekonstituieren und bis zu 1 Jahr bei −80 °C in Einwegaliquoten lagern.

4. Anti-HBV-Eintrittstest

  1. Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
  2. Das Medium absaugen, dann das Curcumin (10-30 μM) oder 4 μM Cyclosporin A (CsA) verdünnt mit William's E-Medium für 2 h hinzufügen. Saugen Sie den Kandidaten HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
  3. HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 100 pro Vertiefung geben und bei 37 °C für 18 h inkubieren. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um das alte Medium mit ungebundenem HBV abzuspülen.
  4. Fügen Sie 2 ml komplettes William's E-Medium hinzu und kultivieren Sie es für 7 Tage. Das Medium absaugen, die Zellen mit 1x PBS waschen und die Zellen mit 3,7% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Permeabilisieren und blockieren Sie die infizierten Zellen mit IF-Blockierungslösung (0,2% Triton X-100 und 3% Rinderserumalbumin in PBS) und inkubieren Sie sie für 60 min bei Raumtemperatur.
  5. Den primären Antikörper (Anti-HBV-Kernantigen) in einer Verdünnung von 1:200 in die Blockierlösung geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 x 1 min mit einer Waschlösung (0,5% Tween 20 in PBS).
  6. Sekundäre Antikörper (1:500 Verdünnung) in die IF-Blockierlösung geben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellen 3 x 1 min mit Waschlösung waschen.
  7. Montieren Sie die Probe mit einem Antifade-Montagemedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem DAPI-Filter (Ex 352-402 nM und Em 417-477) und einem PE-Filter (Ex 542-582 und Em 604-644) sowie einer 20-fachen Objektivlinse ausgestattet ist, und bestimmen Sie die Anti-HBV-Eintrittsaktivität der Kandidatenverbindungen.

5. HBV-Zellbindungsassay

  1. Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
  2. Das Medium absaugen, dann Curcumin (10-30 μM) oder Cyclosporin A (4 μM) in Williams E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Saugen Sie den HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
  3. HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einem MOI von 100 pro Vertiefung geben und bei 4 °C für 2 h inkubieren, um eine HBV-Bindung an die Hepatozyten zu ermöglichen. Verwerfen Sie das Medium, das ungebundenes HBV enthält, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um Spuren des verbrauchten Mediums zu entfernen.
  4. Ernten Sie die infizierten Zellen mit einem Zellschaber und stören Sie die Zellen mit Lysepuffer. Das Lysat wird in ein Sammelröhrchen überführt und die Gesamt-DNA extrahiert, um die HBV-DNA mittels real-time PCR mit spezifischen Primern für HBV (Forward Primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' und Reverse Primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') unter Verwendung von PRNP (Forward Primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', Reverse Primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') als interne Kontrolle zu bewerten.
  5. Amplifizieren Sie die PCR-Produkte in einem Thermocycler unter Verwendung der in Schritt 2.1 beschriebenen Temperaturbedingungen.
  6. Berechnung der relativen HBV-DNA-Spiegel/1 × 106 Zellen in Behandlung versus Kontrolle unter Verwendung von PRNP als Kalibrorgen basierend auf der 2-ΔΔCT-Methode.

6. Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA)

  1. Halten Sie 100% konfluente imHC- und HepaRG-Zellen 14 Tage lang im Reifungsmedium.
  2. Das Medium absaugen und die Hepatozyten mit 1x PBS waschen. Curcumin oder Ciclosporin A (10-50 μM) in William's E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Das Medium durch die Natriumtaurocholsäurelösung (0,5 M Natriumtaurocholsäurehydrat in 1x HEPES) ersetzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Die Natriumtaurocholsäurelösung absaugen und 3x mit kaltem 1x HEPES waschen. Fügen Sie 300-500 μL kaltes 1x HEPES hinzu und ernten Sie die Zellen mit Zellschaber auf Eis.
  4. Die Zellen werden durch Ultraschall bei einer Frequenz von 20 kHz für 20 s homogenisiert und 5 min auf Eis inkubiert. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 10.000 × g für 20 Minuten, um Zelltrümmer auszufällen. Sammeln Sie den Überstand und bewerten Sie die intrazelluläre Taurocholsäurekonzentration mit einem TCA-ELISA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).

7. Bestimmung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen mittels isothermer Titrationskalorimetrie

HINWEIS: Dieses Assay-System wurde auf Basis der MicroCal PEAQ-ITC (ITC-Software) entwickelt.

  1. Bereiten Sie den Puffer vor (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0).
  2. Bereiten Sie 15 μM NTCP im Puffer vor.
  3. Bereiten Sie 150 μM-Kandidaten HBV-Eintrittsinhibitorlösungen im Puffer vor.
  4. Waschen Sie die Probenzelle, die Referenzzelle und die Spritze im ITC-Gerät mit dem Puffer (Schritt 7.1.).
    1. Starten Sie die ITC-Software durch Doppelklick auf das Software-Symbol in Windows-Systemen. Wählen Sie auf der Registerkarte Highlight Run experiment die Option microCal Method for 19 Injection.itcm aus und klicken Sie auf Öffnen. Wenn ein neues Fenster geöffnet wird, klicken Sie auf die Registerkarte Reinigen, und wählen Sie im Fenster Reinigungsmethode die Schaltfläche Waschen für Zellenreinigungsmethode und die Schaltfläche Spülen für Spritzenreinigungsmethode aus. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
      HINWEIS: Der Waschvorgang kann 1,4 Stunden dauern.
  5. Laden Sie die Probe in die ITC; Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Laden und lesen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Videoanweisungen, bis dieser Ladeschritt abgeschlossen ist.
    1. Füllen Sie die Referenzzelle mit einer Spritze mit Lösungspuffer. Füllen Sie die Probenzelle mit 15 μM NTCP im Puffer mit einer Spritze und entfernen Sie die überschüssige NTCP-Lösung über der Probenzelle. Füllen Sie die Spritze mit 150 μM Lösung des Curcumins (Liganden) und vermeiden Sie Luftblasen in der Spritze.
  6. Führen Sie das Beispiel aus, und klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Ausführen . Beobachten Sie die Fenster auf der linken Seite, die experimentelle Informationen und experimentelle Einstellungen anzeigen. Geben Sie die Liganden- und Proteinkonzentrationen als 150 μM in [ Syr], 15 μM in [Zelle] und 25 °C in der Temperatur ein.
  7. Klicken Sie in der Software auf Start , um den Injektionsprozess durchzuführen, und warten Sie 1,4 h, bis die Protein-Liganden-Interaktion abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Die verblasste Schaltfläche Analysieren wird unter den Softwarefenstern angezeigt.
  8. Beachten Sie, dass die Analysetaste nach Abschluss der Injektion heller wird. Klicken Sie auf die Analyseschaltfläche in der Steuerungssoftware, um die Rohdaten mit der Analysesoftware zu analysieren. Klicken Sie auf Übersicht , um die Rohdaten anzuzeigen und wählen Sie das Anpassungsmodell als One Set of Binding Site aus.
  9. Stellen Sie sicher, dass im Bindungsstatus die experimentellen Daten (Bindungs-, keine Bindungs-, Steuer- oder Prüfdaten) und die Experimentwerte (KD, ΔG, ΔH, TΔS und N) im Softwarefenster angezeigt werden.
  10. Exportieren Sie die thermodynamischen Parameter, die die Wechselwirkungsbindung vorhersagen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Bindung und hydrophober Wechselwirkung, in das TIF- oder JPEG-Format.
  11. Nach Abschluss des Experiments waschen Sie die Probenzelle nach Schritt 7.4.

8. Statistische Auswertung

  1. Führen Sie alle Experimente in drei unabhängigen Replikaten durch (n = 3).
  2. Präsentieren Sie experimentelle Daten als Mittel ± SD und führen Sie statistische Analysen mit der gewünschten statistischen Analysesoftware durch.
  3. Verwenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten Studenten-t-Test, um zwischen zwei Mittelwerten zu vergleichen, oder wenden Sie die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett an, um mehrere Werte mit einem Kontrollwert zu vergleichen. Legen Sie das Signifikanzniveau auf p ≤ 0,05 fest.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurden hepatische Reifungsmerkmale beobachtet, einschließlich zweikerniger Zellen und polygonaler Morphologie (Abbildung 1), insbesondere im differenzierten Stadium von imHC (Abbildung 1A). Ein starker Anstieg der NTCP-Expression wurde in d-HepaRG und d-imHC um das 7-fache bzw. 40-fache gemessen (Abbildung 1B). Die stark glykosylierte Form von NTCP, die postuliert wurde, um die Anfälligkeit für den HBV-Eintritt zu verleihen, wurd...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die HBV-Infektion wird über eine niedrigaffine Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPGs) an Hepatozyten25 initiiert, gefolgt von der Bindung an NTCP mit anschließender Internalisierung durch Endozytose26. Da NTCP ein entscheidender Rezeptor für den HBV-Eintritt ist, kann der gezielte HBV-Eintritt klinisch übersetzt werden, um die De-novo-Infektion, die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) und das Rezidiv nach Lebertransplantation zu verringern. Die Unterbrechung des...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Forschungsprojekt wird von der Mahidol University und der Thailand Science Research and Innovation (TSRI) unterstützt und separat an A. Wongkajornsilp und K. Sa-ngiamsuntorn vergeben. Diese Arbeit wurde vom Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council über die Program Management Unit for Competitiveness (Fördernummer C10F630093) finanziell unterstützt. A. Wongkajornsilp ist Empfänger eines Chalermprakiat-Stipendiums der Medizinischen Fakultät Siriraj Hospital, Mahidol University. Die Autoren danken Frau Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) für ihre Unterstützung bei der ITC-Technik.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ZelllinienHepaRG-Zellen
, kryokonserviertThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Humane Hepatoblastom-ZelllinieMerckSCC249
Reagenzien
4% Paraformadehydphosphat-PufferlösungFUJIFLIM Wako chemisch163-20145
BD Perm/Wash PufferBD Biosciences554723Perm/Wash
Puffer Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 DisulfatsalzMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-frei (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA IsolationskitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation KitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse TranskriptionssystemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X KonzentratorTakara bioPT4421-2Konzentrator
Luminata crescendo Western HRP SubstratMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA-Extraktionskitmacherey-nagel1806/003
Phosphatgepufferte KochsalzlösungMerckP3813
Polyethylenglykol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermo scientificP36930
Rekombinantes NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysepuffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Verdünnen auf 0,125%
Antikörper
      Anti-NTCP1-AntikörperAbcamab1310841:100 Verdünnung
      Anti-GAPDH-AntikörperThermo Fisher ScientificAM43001:200.000 Verdünnung
    HRP-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper für ZiegenAbcamab2057181:10.000 Verdünnung
    HRP Ziegen-Anti-Maus-SekundärantikörperAbcamab970231:10.000 Verdünnung
    Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 Verdünnung
Reagenzzusammensetzung
1° Antikörper-Verdünnungspuffer
        1x TBST&
nbsp;       3%BSA SigmaA7906-100GArbeitskonzentration: 3%
        NatriumazidSigma199931Arbeitskonzentration: 0,05
%Hepatozyten-Wachstumsmedium
          DME/F12Gibco12400-024
          10% FBSSigma AldrichF7524
          1% Stift/StreptokokkenHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
Leberreifung medium
          Williams' E mediumSigma AldrichW4125-1L
          10% FBSSigma AldrichF7524
          1% Stift/StreptokokkenHyClonSV30010
          1% GlutaMAXGibco35050-061
          5 & Mikro; g/mL  InsulinSigma Aldrich91077C-100MG
          50 & Mikro; M HydrocotisonSigma AldrichH0888-1g
        2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blockierungslösung
        1x PBSGibco21300-058
        3%BSA SigmaA7906-100GArbeitskonzentration: 3%
        0,2 % Triton X-100SigmaT8787Arbeitskonzentration: 0,2 %
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188Endkonzentration: 1X
        Proteasehemmer CocktailThermo Scientific78425Endkonzentration: 1X
            Na3VO4Endkonzentration: 1 mM
            PMSFEndkonzentration: 1 mM
            NaFEndkonzentration: 10 mM
Western Blot Reagenz
        10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Bio-Rad170-6435Endkonzentration: 1X
        Tween 20Merck9005-64-5
        1x TBST0,1% Tween 20
        1x PBSGibco21300-058
        Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA53225
        Polyacrylamid-GelBio-Rad161-0183
        Ammoniumpersulfat (APS)Bio-Rad161-0700Endkonzentration: 0,05%
      TEMEDBio-Rad161-0800Stacker-Gel: 0,1%, Resolver-Gel: 0,05%
      2x Laemmli ProbenpufferBio-Rad161-0737Endkonzentration: 1X
      Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Blockierungslösung/ 2° Antikörper-Verdünnungspuffer
        1x TBST&
nbsp;       5% Magermilch (fettfreie Trockenmilch)Bio-Rad170-6404Arbeitskonzentration: 5
%1x Laufpuffer 1 L
          10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Bio-Rad170-6435Endkonzentration: 1X
        GlycinSigmaG889814,4 g
        SDSMerck7910Arbeitskonzentration: 0,1 %
Blot-Transferpuffer 500 mL
          10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Bio-Rad170-6435Endkonzentration: 1X
        GlycinSigmaG88987,2 g
        MethanolMerck106009100
mLMilde Stripping-Lösung 1 LpH-Wert auf 2,2
nbsp; einstellen     GlycinSigmaG889815 g
        SicherheitsdatenblattMerck79101 g
        Tween 20Merck9005-64-510
mLEquipments
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning430052
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Biologische Sicherheitswerkbank
CelCulture CO2 InkubatorEsco2170002Inkubator für befeuchtete Gewebekulturen
CFX96 Touch Real-Time PCR DetektorBio-Rad1855196
FACSVerse DurchflusszytometerBD Biosciences651154
Messpipetten (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Messpipetten (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernIsotherme Titrationskalorimeter
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Elektrophoresekammer
Mini Trans-blot absorbierendes FilterpapierBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
PipettensteuerungEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Netzteil
PVDF-MembranMerckIPVH00010
T-75 ZellkulturkolbenCorning431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad1703940Semi-Dry Transfer
Cell Ultraschall-Prozessor (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materialien
Versati TischkühlzentrifugeEscoT1000RZentrifuge mit schwingendem Schaufelrotar
&

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

NTCP BindungHemmung des viralen EintrittsDurchflusszytometrieIsotherme TitrationskalorimetrieTaurochols ure AufnahmeImmunfluoreszenzf rbungHepaRG ZellenPolymerase Kettenreaktion

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