Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.
Abstract
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt als entscheidender Risikofaktor für das hepatozelluläre Karzinom. Die derzeitige Behandlung kann nur die Viruslast verringern, aber nicht zu einer vollständigen Remission führen. Ein effizientes Hepatozytenmodell für HBV-Infektionen würde einen lebensechten viralen Lebenszyklus bieten, der für das Screening von Therapeutika entscheidend wäre. Die meisten verfügbaren Anti-HBV-Wirkstoffe zielen auf Lebenszyklusphasen nach dem viralen Eintritt ab, aber nicht vor dem Viruseintritt. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines kompetenten Hepatozytenmodells, das in der Lage ist, nach Therapeutika zu suchen, die auf prävirale und postvirale Eintrittsphasen abzielen. Dies umfasst das Targeting der Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid-Bindung (NTCP), die cccDNA-Bildung, die Transkription und die virale Assemblierung basierend auf imHC oder HepaRG als Wirtszellen. Hier verwendete der HBV-Eintrittshemmungsassay Curcumin, um HBV-Bindungs- und Transportfunktionen über NTCP zu hemmen. Die Inhibitoren wurden auf Bindungsaffinität (KD) mit NTCP unter Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) – einem universellen Werkzeug für das HBV-Arzneimittelscreening basierend auf thermodynamischen Parametern – untersucht.
Introduction
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt weltweit als lebensbedrohliche Krankheit. Eine chronische HBV-Infektion birgt ein Risiko für Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom1. Die derzeitige Anti-HBV-Behandlung konzentriert sich hauptsächlich auf den postviralen Eintritt unter Verwendung von Nukleos(t)ide-Analoga (NAs) und Interferon-alpha (IFN-α)2,3. Die Entdeckung eines HBV-Eintrittsinhibitors, Myrcludex B, hat ein neues Ziel für Anti-HBV-Wirkstoffe identifiziert4. Die Kombination von Eintrittsinhibitoren und NAs bei chronischem HBV hat die Viruslast im Vergleich zu denen, die nur auf die Virusreplikation abzielen, signifikant verringert 5,6. Das klassische Hepatozytenmodell für das Screening von HBV-Eintrittsinhibitoren ist jedoch durch niedrige virale Rezeptorspiegel (Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid, NTCP) begrenzt. Die Überexpression von hNTCP in Hepatomzellen (d.h. HepG2 und Huh7) verbessert die HBV-Infektiosität 7,8. Dennoch exprimieren diese Zelllinien geringe Mengen an medikamentenmetabolisierenden Enzymen der Phasen I und II und weisen eine genetische Instabilität auf9. Hepatozytenmodelle, die helfen können, verschiedene Mechanismen von Anti-HBV-Kandidatenverbindungen wie präviralen Eintrag, NTCP-Bindung und viralen Eintritt anzusprechen, würden die Identifizierung und Entwicklung wirksamer Kombinationsschemata beschleunigen. Die Studie zur Anti-HBV-Aktivität von Curcumin hat die Hemmung des Viruseintritts als neuen Mechanismus zusätzlich zur postviralen Eintrittsunterbrechung aufgeklärt. Dieses Protokoll beschreibt ein Wirtsmodell für das Screening von Anti-HBV-Eintrittsmolekülen10.
Das Ziel dieser Methode ist es, mögliche Anti-HBV-Verbindungen für die Hemmung des Viruseintritts zu erforschen, insbesondere die Blockierung der NTCP-Bindung und des NTCP-Transports. Da die NTCP-Expression ein kritischer Faktor für den HBV-Eintritt und die Infektion ist, haben wir das Hepatozyten-Reifungsprotokoll optimiert, um die NTCP-Wertezu maximieren 11. Darüber hinaus kann dieses Protokoll die hemmende Wirkung auf den HBV-Eintritt als Hemmung der HBV-Bindung gegenüber Hemmung der Internalisierung unterscheiden. Der Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA) wurde ebenfalls unter Verwendung einer ELISA-basierten Methode anstelle eines Radioisotops modifiziert, um den NTCP-Transport12,13 darzustellen. Die Rezeptor- und Ligandeninteraktion wurde durch ihre 3D-Strukturenbestätigt 14,15. Die Hemmung der NTCP-Funktion kann durch Messung der TCA-Aufnahmeaktivität16 bewertet werden. Diese Technik lieferte jedoch keinen direkten Nachweis einer NTCP-Bindung an die Kandidaten-Inhibitoren. Daher kann die Bindung mit verschiedenen Techniken untersucht werden, wie z.B. Oberflächenplasmonresonanz 17, ELISA, fluoreszenzbasierter Thermoverschiebungsassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen und verschiedenen anderen Methoden20. Unter diesen Techniken ist ITC ein Zielstandard in der Bindungsanalyse, da es Wärmeabsorption oder -emission in fast jeder Reaktion beobachten kann21. Die Bindungsaffinität (KD) von NTCP und Kandidatenverbindungen wurde direkt mittels ITC bewertet; Diese Affinitätswerte waren genauer als diejenigen, die mit dem In-silico-Vorhersagemodell 22 ermittelt wurden.
Dieses Protokoll behandelt Techniken zur Hepatozytenreifung, HBV-Infektion und zum Screening auf HBV-Eintrittshemmer. Kurz gesagt, ein Hepatozytenmodell wurde basierend auf imHC- und HepaRG-Zelllinien entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden innerhalb von 2 Wochen zu reifen Hepatozyten differenziert. Die Hochregulierung der NTCP-Spiegel wurde mittels real-time PCR, Western Blot und Durchflusszytometrienachgewiesen 11. Hepatitis-B-Virion (HBVcc) wurde produziert und aus HepG2.2.15 gesammelt. Das differenzierte imHC bzw. HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) wurde 2 h vor der Inokulation mit HBV-Virion prophylaktisch mit den Anti-HBV-Kandidaten behandelt. Das erwartete Ergebnis des Experiments war die Identifizierung der Wirkstoffe, die zelluläres HBV und Infektiosität verringern. Die Anti-NTCP-Aktivität wurde mit dem TCA-Aufnahmetest bewertet. Die NTCP-Aktivität konnte von den Agenten unterdrückt werden, die NTCP spezifisch gebunden haben. Die ITC-Technik wurde verwendet, um die Machbarkeit einer interaktiven Bindung zu untersuchen, die Inhibitoren und ihre Zielproteine vorhersagen kann, indem die Bindungsaffinität (KD) des Liganden für den Rezeptor über nicht-kovalente Wechselwirkungen des biomolekularen Komplexesbestimmt wird 23,24. Zum Beispiel steht K D ≥ 1 × 103 mM für schwache Bindung, K D ≥ 1 × 106 μM für moderate Bindung und K D ≤ 1 × 109 nM für starke Bindung. Das ΔG korreliert direkt mit Bindungswechselwirkungen. Insbesondere ist eine Reaktion mit negativem ΔG eine exergonische Reaktion, was darauf hinweist, dass die Bindung ein spontaner Prozess ist. Eine Reaktion mit einem negativen ΔH deutet darauf hin, dass die Bindungsprozesse von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräften abhängen. Sowohl TCA-Aufnahme als auch ITC-Daten könnten verwendet werden, um nach Anti-HBV-Eintragsagenten zu suchen. Die Ergebnisse dieser Protokolle können eine Grundlage nicht nur für das Anti-HBV-Screening bilden, sondern auch für die Interaktion mit NTCP, die durch Bindungsaffinität und Transportfunktion bewertet wird. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung und Charakterisierung von Wirtszellen, das experimentelle Design und die Bewertung des Anti-HBV-Eintritts zusammen mit der NTCP-Bindungsaffinität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die HBV-Infektion wird über eine niedrigaffine Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPGs) an Hepatozyten25 initiiert, gefolgt von der Bindung an NTCP mit anschließender Internalisierung durch Endozytose26. Da NTCP ein entscheidender Rezeptor für den HBV-Eintritt ist, kann der gezielte HBV-Eintritt klinisch übersetzt werden, um die De-novo-Infektion, die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) und das Rezidiv nach Lebertransplantation zu verringern. Die Unterbrechun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Forschungsprojekt wird von der Mahidol University und der Thailand Science Research and Innovation (TSRI) unterstützt und separat an A. Wongkajornsilp und K. Sa-ngiamsuntorn vergeben. Diese Arbeit wurde vom Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council über die Program Management Unit for Competitiveness (Fördernummer C10F630093) finanziell unterstützt. A. Wongkajornsilp ist Empfänger eines Chalermprakiat-Stipendiums der Medizinischen Fakultät Siriraj Hospital, Mahidol University. Die Autoren danken Frau Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) für ihre Unterstützung bei der ITC-Technik.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
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