Компетентная модель гепатоцитов, исследующая проникновение вируса гепатита В через таурохолат натрия, котранспортирующий полипептид в качестве терапевтической мишени
Summary
Мы представляем протокол скрининга соединений вируса гепатита В (HBV), нацеленных на стадии жизненного цикла до и после вирусного входа, с использованием изотермической титрующей калориметрии для измерения сродства связывания (KD) с котранспортирующим полипептидом таурохолата натрия хозяина. Противовирусную эффективность определяли путем подавления маркеров жизненного цикла вируса (образование cccDNA, транскрипция и вирусная сборка).
Abstract
Инфекция вируса гепатита В (HBV) считается решающим фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы. Текущее лечение может только уменьшить вирусную нагрузку, но не привести к полной ремиссии. Эффективная модель гепатоцитов для инфекции HBV обеспечит реальный жизненный цикл вируса, который будет иметь решающее значение для скрининга терапевтических агентов. Большинство доступных анти-HBV агентов нацелены на этапы жизненного цикла после поступления вируса, но не до проникновения вируса. Этот протокол детализирует создание компетентной модели гепатоцитов, способной проводить скрининг на терапевтические агенты, нацеленные на стадии жизненного цикла довирусного входа и после вирусного входа. Это включает в себя нацеливание на связывание таурохолата таурохолата натрия (NTCP), образование, транскрипцию и вирусную сборку на основе imHC или HepaRG в качестве клеток-хозяев. Здесь анализ ингибирования входа HBV использовал куркумин для ингибирования функций связывания и транспортировки HBV через NTCP. Ингибиторы оценивали на сродство связывания (KD) с NTCP с использованием изотермической титрационной калориметрии (ITC) – универсального инструмента для скрининга лекарств HBV на основе термодинамических параметров.
Introduction
Инфекция, вызванная вирусом гепатита В (HBV), считается опасным для жизни заболеванием во всем мире. Хроническая инфекция HBV сопряжена с риском цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы1. Современное лечение анти-HBV фокусируется в основном на поствирусном введении с использованием аналогов нуклеоса (t)ide (NA) и интерферона-альфа (IFN-α)2,3. Открытие ингибитора входа HBV, Myrcludex B, определило новую мишень для анти-HBV агентов4. Комбинация ингибиторов входа и АНА при хроническом HBV значительно снизила вирусную нагрузку по сравнению с теми, которые нацелены только на репликацию вируса 5,6. Однако классическая модель гепатоцитов для скрининга ингибиторов входа HBV ограничена низкими уровнями вирусных рецепторов (котранспортирующий полипептид таурохолата натрия, NTCP). Сверхэкспрессия hNTCP в клетках гепатомы (т.е. HepG2 и Huh7) улучшает инфекционность HBV 7,8. Тем не менее, эти клеточные линии экспрессируют низкие уровни ферментов, метаболизирующих лекарства фазы I и II, и проявляют генетическую нестабильность9. Модели гепатоцитов, которые могут помочь нацелиться на различные механизмы соединений-кандидатов против HBV, такие как превирусное вступление, связывание NTCP и проникновение вируса, ускорят идентификацию и разработку эффективных комбинированных схем. Исследование анти-HBV активности куркумина прояснило ингибирование проникновения вируса в качестве нового механизма в дополнение к прерыванию поствирусного входа. Этот протокол детализирует модель хозяина для скрининга входных молекул10 против HBV.
Целью этого метода является изучение потенциальных анти-HBV соединений для ингибирования проникновения вируса, особенно блокирования связывания и транспорта NTCP. Поскольку экспрессия NTCP является критическим фактором для входа в HBV и инфекции, мы оптимизировали протокол созревания гепатоцитов, чтобы максимизировать уровни NTCP11. Кроме того, этот протокол может дифференцировать ингибирующее действие на вход HBV как ингибирование прикрепления HBV по сравнению с ингибированием интернализации. Анализ поглощения таурохолевой кислоты (ТЦА) также модифицировали с использованием метода на основе ИФА вместо радиоизотопа для представления переноса NTCP12,13. Взаимодействие рецептора и лиганда было подтверждено их 3D структурами14,15. Ингибирование функции NTCP может быть оценено путем измерения активности поглощения TCA16. Однако этот метод не предоставил прямых доказательств связывания NTCP с ингибиторами-кандидатами. Таким образом, связывание может быть исследовано с использованием различных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс17, ИФА, анализ теплового сдвига на основе флуоресценции (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen и различные другие методы20. Среди этих методов ITC является целевым стандартом в анализе связывания, поскольку он может наблюдать поглощение тепла или излучение почти в каждой реакции21. Сродство связывания (KD) NTCP и соединений-кандидатов оценивали непосредственно с использованием ITC; эти значения сродства были более точными, чем те, которые были получены с использованием модели прогнозирования in silico 22.
Этот протокол охватывает методы созревания гепатоцитов, инфекции HBV и скрининга на ингибитор входа HBV. Вкратце, модель гепатоцитов была разработана на основе клеточных линий imHC и HepaRG. Культивируемые клетки дифференцировали в зрелые гепатоциты в течение 2 недель. Повышение уровня NTCP было обнаружено с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии11. Вирион гепатита В (HBVcc) был получен и собран из HepG2.2.15. Дифференцированный imHC или HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) профилактически лечили анти-HBV кандидатами за 2 ч до инокуляции вирионом HBV. Ожидаемым результатом эксперимента стала идентификация агентов, снижающих клеточный HBV и инфекционность. Анти-NTCP активность оценивали с использованием анализа поглощения TCA. Активность NTCP может быть подавлена агентами, которые специально связывали NTCP. Метод ITC был использован для исследования возможности интерактивного связывания, которое могло бы предсказывать ингибиторы и их белки-мишени, определяя сродство связывания (KD) лиганда для рецептора посредством нековалентных взаимодействий биомолекулярного комплекса23,24. Например, KD ≥ 1 × 103 мМ представляет собой слабое связывание, KD ≥ 1 × 106 мкМ представляет собой умеренное связывание, а KD ≤ 1 × 109 нМ представляет собой сильное связывание. ΔG напрямую коррелирует с связывающими взаимодействиями. В частности, реакция с отрицательным ΔG является экзергонической реакцией, указывающей на то, что связывание является спонтанным процессом. Реакция с отрицательным ΔH указывает на то, что процессы связывания зависят от водородной связи и сил Ван-дер-Ваальса. Как поглощение TCA, так и данные ITC могут быть использованы для скрининга агентов против HBV. Результаты этих протоколов могут обеспечить основу не только для скрининга против HBV, но и для взаимодействия с NTCP, оцениваемого через сродство связывания и транспортную функцию. В этой статье описывается подготовка и характеристика клеток-хозяев, экспериментальное проектирование и оценка входа анти-HBV вместе с сродством связывания NTCP.
Protocol
Representative Results
Discussion
HbV-инфекция инициируется через низкоаффинное связывание с протеогликанами гепарана сульфата (HSPG) на гепатоцитах25 с последующим связыванием с NTCP с последующей интернализацией через эндоцитоз26. Поскольку NTCP является критически важным рецептором для входа HBV, н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот исследовательский проект поддерживается Университетом Махидол и Таиландским научным исследованием и инновациями (TSRI), отдельно присуждаемым А. Вонгкаджорнсилпу и К. Са-нгиамсунторну. Эта работа была финансово поддержана Управлением Национального совета по научным исследованиям и инновационной политике в области высшего образования через Отдел управления программами по конкурентоспособности (номер гранта C10F630093). A. Wongkajornsilp является получателем гранта Chalermprakiat медицинского факультета больницы Сирирадж Университета Махидол. Авторы хотели бы поблагодарить мисс Савини Симахан (Отличный центр по открытию лекарств, факультет естественных наук, Университет Махидол) за ее помощь с техникой ITC.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
