Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

Summary

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (K_D) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

Abstract

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) tem sido considerada um fator de risco crucial para o carcinoma hepatocelular. O tratamento atual só pode diminuir a carga viral, mas não resultar em remissão completa. Um modelo eficiente de hepatócitos para a infecção pelo HBV ofereceria um ciclo de vida viral realista que seria crucial para a triagem de agentes terapêuticos. A maioria dos agentes anti-HBV disponíveis tem como alvo os estágios do ciclo de vida após a entrada viral, mas não antes da entrada viral. Este protocolo detalha a geração de um modelo de hepatócitos competente, capaz de rastrear agentes terapêuticos visando os estágios do ciclo de vida pré-entrada viral e pós-entrada viral. Isso inclui o direcionamento da ligação do polipeptídeo de cotransporte de taurocolato de sódio (NTCP), formação de cccDNA, transcrição e montagem viral com base em imHC ou HepaRG como células hospedeiras. Aqui, o ensaio de inibição de entrada do HBV usou curcumina para inibir as funções de ligação e transporte do HBV via NTCP. Os inibidores foram avaliados quanto à afinidade de ligação (K_D) com o NTCP usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC) – uma ferramenta universal para triagem de drogas do HBV com base em parâmetros termodinâmicos.

Introduction

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é considerada uma doença com risco de vida em todo o mundo. A infecção crônica pelo VHB é carregada de risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular¹. O tratamento anti-HBV atual concentra-se principalmente na entrada pós-viral usando análogos de nucleos(t)ide (NAs) e interferon-alfa (IFN-α)^2,3. A descoberta de um inibidor da entrada do VHB, o Myrcludex B, identificou um novo alvo para os agentes anti-VHB⁴. A combinação de inibidores de entrada e NAs no HBV crônico diminuiu significativamente a carga viral em comparação com aqueles que visam apenas a replicação viral ^5,6. No entanto, o modelo clássico de hepatócitos para a triagem de inibidores da entrada do HBV é limitado por baixos níveis de receptores virais (polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio, NTCP). A superexpressão de hNTCP em células de hepatoma (ou seja, HepG2 e Huh7) melhora a infectividade do HBV ^7,8. No entanto, essas linhagens celulares expressam baixos níveis de enzimas metabolizadoras de drogas de fase I e II e apresentam instabilidade genética⁹. Modelos de hepatócitos que podem ajudar a direcionar mecanismos distintos de compostos anti-HBV candidatos, como entrada pré-viral, ligação ao NTCP e entrada viral, agilizariam a identificação e o desenvolvimento de regimes de combinação eficazes. O estudo para a atividade anti-HBV da curcumina elucidou a inibição da entrada viral como um novo mecanismo, além da interrupção da entrada pós-viral. Este protocolo detalha um modelo hospedeiro para a triagem de moléculas de entrada anti-HBV¹⁰.

O objetivo deste método é explorar compostos anti-HBV candidatos para inibição da entrada viral, especialmente bloqueando a ligação e o transporte de NTCP. Como a expressão de NTCP é um fator crítico para a entrada e infecção pelo HBV, otimizamos o protocolo de maturação de hepatócitos para maximizar os níveis de NTCP¹¹. Além disso, esse protocolo pode diferenciar o efeito inibitório sobre a entrada do HBV como inibição da ligação do HBV versus inibição da internalização. O ensaio de captação de ácido taurocólico (TCA) também foi modificado usando um método baseado em ELISA em vez de um radioisótopo para representar o transporte de NTCP^12,13. A interação receptor e ligante foi confirmada por suas estruturas 3D^14,15. A inibição da função NTCP pode ser avaliada pela mensuração da atividade de captação do TCA¹⁶. No entanto, esta técnica não forneceu evidências diretas de ligação do NTCP aos inibidores candidatos. Portanto, a ligação pode ser investigada usando várias técnicas, como ressonância plasmônica^{de superfície 17}, ELISA, ensaio de deslocamento térmico baseado em fluorescência (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen e vários outros métodos²⁰. Dentre essas técnicas, a ITC é um padrão de meta na análise de ligação, pois pode observar absorção ou emissão de calor em quase todas as reações²¹. A afinidade de ligação (K_D) do NTCP e dos compostos candidatos foi avaliada diretamente por meio do ITC; esses valores de afinidade foram mais precisos do que os obtidos por meio do modelo de predição in silico ²².

Este protocolo abrange técnicas de maturação de hepatócitos, infecção por HBV e triagem para inibidor de entrada de HBV. Resumidamente, um modelo de hepatócitos foi desenvolvido com base em linhagens celulares imHC e HepaRG. As células cultivadas foram diferenciadas em hepatócitos maduros dentro de 2 semanas. A regulação positiva dos níveis de NTCP foi detectada por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo¹¹. O virion da hepatite B (HBVcc) foi produzido e coletado da HepG2.2.15. O imHC ou HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) foi tratado profilaticamente com os candidatos anti-HBV 2 h antes da inoculação com virion HBV. O resultado esperado do experimento foi a identificação dos agentes que diminuem o HBV celular e a infectividade. A atividade anti-NTCP foi avaliada usando o ensaio de captação de TCA. A atividade do NTCP pode ser suprimida pelos agentes que vincularam especificamente o NTCP. A técnica ITC foi empregada para investigar a viabilidade de ligações interativas que pudessem predizer inibidores e suas proteínas-alvo, determinando a afinidade de ligação (K_D) do ligante pelo receptor via interações não covalentes do complexo biomolecular^23,24. Por exemplo, K D ≥ 1 × 10³ mM representa ligação fraca, K D ≥ 1 × 10⁶ μM representa ligação moderada e K _D ≤ 1 × 10⁹ nM representa ligação forte. O ΔG está diretamente correlacionado com as interações de ligação. Em particular, uma reação com ΔG negativo é uma reação exergônica, indicando que a ligação é um processo espontâneo. Uma reação com um ΔH negativo indica que os processos de ligação dependem da ligação de hidrogênio e das forças de Van der Waals. Tanto a aceitação do TCA quanto os dados do ITC podem ser usados para rastrear agentes de entrada anti-HBV. Os resultados desses protocolos podem fornecer uma base não apenas para a triagem anti-HBV, mas também para a interação com o NTCP, conforme avaliado por meio da afinidade de ligação e da função de transporte. Este trabalho descreve a preparação e caracterização da célula hospedeira, o desenho experimental e a avaliação da entrada anti-HBV, juntamente com a afinidade de ligação do NTCP.

Protocol

NOTA: Os seguintes procedimentos devem ser realizados num exaustor de fluxo de risco biológico de classe II ou num exaustor de fluxo laminar. O manuseio do HBV foi eticamente aprovado pelo IRB (MURA2020/1545). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todas as soluções, reagentes, equipamentos e linhas celulares usadas neste protocolo. 1. Preparação das células hospedeiras (hepatócitos maduros) Cultivar hepatócitos (3,75 × 10<…

Representative Results

Foram observadas características de maturação hepática, incluindo células binucleadas e morfologia poligonal (Figura 1), especialmente no estágio diferenciado do imHC (Figura 1A). Um grande aumento na expressão de NTCP foi medido em d-HepaRG e d-imHC em 7 e 40 vezes, respectivamente (Figura 1B). A forma altamente glicosilada do NTCP, postulada para conferir suscetibilidade à entrada do HBV, foi detectada mais no d-imHC do qu…

Discussion

A infecção pelo VHB é iniciada via ligação de baixa afinidade aos proteoglicanos do sulfato de heparano (HSPGs) nos hepatócitos²⁵, seguida pela ligação ao NTCP com subsequente internalização por endocitose²⁶. Como o NTCP é um receptor crucial para a entrada no HBV, a segmentação da entrada no HBV pode ser clinicamente traduzida para diminuir a infecção de novo, a transmissão de mãe para filho (MTCT) e a recorrência após o transplante hepático. I…

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved	Thermo Fisher Scientific	HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line	Merck	SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution	FUJIFLIM Wako chemical	163-20145
BD Perm/Wash buffer	BD Biosciences	554723	Perm/Wash buffer
Cyclosporin A	abcam	59865-13-3
EDTA	Invitrogen	15575-038	8 mM
G 418 disulfate salt	Merck	108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)	Thermo Scientific	78425
HEPES	Merck	7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits	GE Healthcare	25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit	GE Healthcare	25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit	Kapa Biosystems	KK4600
Lenti-X Concentrator	Takara bio	PT4421-2	concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate	Merck	WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal	Kapa Biosystems	KK4600
Nucleospin DNA extraction kit	macherey-nagel	1806/003
Phosphate buffered saline	Merck	P3813
Polyethylene glycol 8000	Merck	25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo scientific	P36930
Recombinant NTCP	Cloud-Clone	RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)	Merck	20-188
TCA	Sigma	345909-26-4
TCA Elisa kit	Mybiosource	MB2033685
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Dilute to 0.125%
Antibodies
Anti-NTCP1 antibody	Abcam	ab131084	1:100 dilution
Anti-GAPDH antibody	Thermo Fisher Scientific	AM4300	1:200,000 dilution
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab205718	1:10,000 dilution
HRP goat anti-mouse secondary antibody	Abcam	ab97023	1:10,000 dilution
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
1x TBST
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
Sodium azide	Sigma	199931	Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
DME/F12	Gibco	12400-024
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
Hepatic maturation medium
Williams’ E medium	Sigma Aldrich	W4125-1L
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
5 µg/mL  Insulin	Sigma Aldrich	91077C-100MG
50 µM hydrocotisone	Sigma Aldrich	H0888-1g
2% DMSO	PanReac AppliChem	A3672-250ml
IF Blocking solution
1x PBS	Gibco	21300-058
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
0.2% Triton X-100	Sigma	T8787	Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution	Merck	20-188	Final concentration: 1X
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78425	Final concentration: 1X
Na3VO4			Final concentration: 1 mM
PMSF			Final concentration: 1 mM
NaF			Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Tween 20	Merck	9005-64-5
1x TBST			0.1% Tween 20
1x PBS	Gibco	21300-058
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A53225
Polyacrylamide gel	Bio-Rad	161-0183
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	Final concentration: 0.05%
TEMED	Bio-Rad	161-0800	Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737	Final concentration: 1X
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
1x TBST
5% Skim milk (nonfat dry milk)	Bio-Rad	170-6404	Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	14.4 g
SDS	Merck	7910	Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	7.2 g
Methanol	Merck	106009	100 mL
Mild stripping solution 1 L			Adjust pH to 2.2
Glycine	Sigma	G8898	15 g
SDS	Merck	7910	1 g
Tween 20	Merck	9005-64-5	10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube	Corning	430052
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
Airstream Class II	Esco	2010621	Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator	Esco	2170002	Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector	Bio-Rad	1855196
FACSVerse Flow Cytometer	BD Biosciences	651154
Graduated pipettes (10 mL)	Jet Biofil	GSP010010
Graduated pipettes (5 mL)	Jet Biofil	GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC	Malvern		Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004	Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper	Bio-Rad	1703932
Omega Lum G Imaging System	Aplegen	8418-10-0005
Pipette controller	Eppendorf	4430000.018	Easypet 3
PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Power supply
PVDF membrane	Merck	IPVH00010
T-75 A91:D106flask	Corning	431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	1703940	Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)	Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge	Esco	T1000R	Centrifuge with swinging bucket rotar