Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.
Les interactions cellule-matrice interviennent dans des processus physiologiques complexes par le biais d’indices biochimiques, mécaniques et géométriques, influençant les changements pathologiques et les réponses thérapeutiques. La prise en compte des effets matriciels plus tôt dans le développement de médicaments devrait augmenter la probabilité de succès clinique de nouveaux traitements. Il existe des stratégies basées sur les biomatériaux récapitulant des microenvironnements tissulaires spécifiques en culture cellulaire 3D, mais leur intégration avec les méthodes de culture 2D principalement utilisées pour le dépistage des drogues a été difficile. Ainsi, le protocole présenté ici détaille le développement de méthodes de culture 3D au sein de matrices de biomatériaux miniaturisés dans un format de plaque multi-puits pour faciliter l’intégration avec les pipelines de dépistage de médicaments existants et les tests conventionnels pour la viabilité cellulaire. Étant donné que les caractéristiques matricielles essentielles à la préservation des phénotypes cliniquement pertinents dans les cellules cultivées devraient être hautement spécifiques aux tissus et aux maladies, un dépistage combinatoire des paramètres de la matrice sera nécessaire pour identifier les conditions appropriées pour des applications spécifiques. Les méthodes décrites ici utilisent un format de culture miniaturisé pour évaluer les réponses des cellules cancéreuses à la variation orthogonale de la mécanique matricielle et à la présentation des ligands. Plus précisément, cette étude démontre l’utilisation de cette plate-forme pour étudier les effets des paramètres de matrice sur les réponses des cellules de glioblastome dérivées du patient (GBM) à la chimiothérapie.
Le coût prévu du développement d’un nouveau médicament n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière décennie, avec plus de 1 milliard de dollars dans les estimations actuelles1. Une partie de cette dépense est due au taux élevé d’échec des médicaments entrant dans les essais cliniques. Environ 12% des candidats médicaments ont finalement obtenu l’approbation de la Food & Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019. De nombreux médicaments échouent en phase I en raison d’une toxicité imprévue2, tandis que d’autres qui réussissent les essais de sécurité peuvent échouer en raison d’un manque d’efficacité3. Cette attrition due à la non-efficacité peut s’expliquer en partie par le fait que les modèles de cancer utilisés lors du développement de médicaments sont notoirement non prédictifs de l’efficacité clinique4.
Les disparités fonctionnelles entre les modèles in vitro et in vivo peuvent être attribuées à l’élimination des cellules cancéreuses de leur microenvironnement natif, y compris les cellules non tumorales et l’ECMphysique 5,6. Généralement, les groupes de recherche utilisent des matrices de culture disponibles dans le commerce, telles que Matrigel (une matrice de membrane basale protéinée dérivée de sarcomes de souris) pour fournir aux cellules tumorales cultivées un microenvironnement matriciel 3D. Par rapport à la culture 2D, la culture 3D dans une matrice membranaire a amélioré la pertinence clinique des résultats in vitro 7,8. Cependant, les biomatériaux de culture à partir de tissus décellularisés, y compris la matrice membranaire, présentent généralement une variabilité d’un lot à l’autre qui peut compromettre la reproductibilité9. En outre, les matrices dérivées de tumeurs d’origine tissulaire différente de celles étudiées peuvent ne pas fournir les indices physiologiques appropriés10. Enfin, les cancers à haut degré d’hétérogénéité intratumorale ont des caractéristiques microenvironnementales qui varient sur une échelle submicronique et que la matrice membranaire ne peut pas être réglée pour récapituler11.
Le glioblastome (GBM), une tumeur cérébrale uniformément mortelle avec un temps de survie médian d’environ 15 mois, est un cancer pour lequel le développement du traitement a été particulièrement difficile12,13. La norme actuelle de soins pour le GBM consiste en une résection de la tumeur primaire, suivie d’une radiothérapie, puis d’une chimiothérapie à l’aide de témozolomide (TMZ)14. Pourtant, plus de la moitié des tumeurs CLINIQUES GBM présentent une résistance au traitement par divers mécanismes 15,16,17. Il est extrêmement difficile de prédire l’efficacité d’un schéma thérapeutique pour un patient individuel. Les modèles précliniques standard utilisés pour prédire les résultats individuels consistent en des cellules tumorales dérivées de patients xénogreffées orthotopiquement dans des souris immunodéprimées. Bien que les xénogreffes dérivées du patient puissent récapituler de nombreux aspects des tumeurs cliniques GBM et soient précieuses pour les modèles précliniques18, elles sont intrinsèquement coûteuses, à faible débit, prennent beaucoup de temps et impliquent des préoccupations éthiques19. Les cultures de cellules dérivées de patients, sur des surfaces en plastique 2D ou sous forme de sphéroïdes, évitent généralement ces problèmes. Alors que les cellules dérivées de patients préservent les aberrations génétiques, leurs cultures en 2D ou sous forme de sphéroïdes en suspension ont été en grande partie de mauvaises représentations de xénogreffes dérivées de patients chez des rongeurs et des tumeurs originalesde patients 20. Auparavant, nous, et d’autres, avons montré que les cellules GBM cultivées dans un ECM 3D qui imite les propriétés mécaniques et biochimiques du tissu cérébral peuvent préserver les phénotypes de résistance aux médicaments 10,21,22,23.
Les interactions entre l’acide hyaluronique (HA), un polysaccharide abondant dans l’ECM cérébral et surexprimé dans les tumeurs GBM, et son récepteur CD44 modulent l’acquisition de la résistance aux médicaments in vitro 21,24,25,26,27. Par exemple, l’inclusion de l’AH dans des cultures 3D molles a augmenté la capacité des cellules GBM dérivées du patient à acquérir une résistance thérapeutique. Cette mécano-réceptivité dépendait de la liaison de l’AH aux récepteurs CD44 sur les cellules GBM21. De plus, la liaison de l’intégrine aux peptides porteurs de RGD, incorporée dans des matrices de culture 3D, a amplifié la chimiorésistance médiée par CD44 d’une manière dépendante de la rigidité21. Au-delà de l’AH, l’expression de plusieurs protéines ECM, dont beaucoup contiennent des régions RGD, varie entre le cerveau normal et les tumeurs GBM28. Par exemple, une étude a rapporté que 28 protéines ECM distinctes étaient régulées à la hausse dans les tumeurs GBM29. Dans ce microenvironnement complexe de la matrice tumorale, les cellules cancéreuses intègrent des indices mécaniques et biochimiques pour produire un phénotype de résistance particulier, qui dépend de différences relativement faibles (par exemple, moins d’un ordre de grandeur) dans le module de Young ou la densité des peptides liant l’intégrine 28,29,30.
Le présent protocole caractérise la façon dont les cellules tumorales interprètent des combinaisons uniques d’indices matriciels et identifient des microenvironnements matriciels complexes et spécifiques au patient qui favorisent la résistance au traitement (Figure 1A). Une méthode photochimique pour générer des matrices miniaturisées et réglées avec précision pour la culture 3D fournit un grand espace variable orthogonal. Une gamme de LED sur mesure, gérée par un microcontrôleur, a été incorporée aux hydrogels de photocroisillon dans un format de plaque à 384 puits pour augmenter l’automatisation et la reproductibilité. L’intensité de l’exposition a varié d’un puits à l’autre pour modifier les propriétés micromécaniques des hydrogels résultants, telles qu’évaluées à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Bien que ce manuscrit ne se concentre pas sur la construction du réseau d’éclairage lui-même, un schéma de circuit (Figure 1B) et une liste de pièces (Table des matériaux) sont fournis comme aides à la reproduction de l’appareil.
Ce rapport démontre la génération rapide d’un ensemble de cellules GBM cultivées dans des microenvironnements 3D uniques dans lesquels le module de Young (quatre niveaux sur un seul ordre de grandeur) et la teneur en peptides liant l’intégrine (dérivés de quatre protéines ECM différentes) ont varié orthogonalement. L’approche a ensuite été utilisée pour étudier les contributions relatives de la mécanique de l’hydrogel et de l’engagement de l’intégrine spécifique à l’ECM sur la viabilité et la prolifération des cellules GBM dérivées du patient à mesure qu’elles acquièrent une résistance à la chimiothérapie au témozolomide (TMZ).
Les travaux actuels présentent des méthodes pour générer des cultures miniaturisées 3D à base d’AH tout en modifiant simultanément la rigidité de la matrice et les peptides disponibles pour l’engagement de l’intégrine. Cette technique permet d’étudier systématiquement comment les paramètres de la matrice affectent les phénotypes cellulaires (par exemple, la viabilité des cellules cancéreuses exposées à la chimiothérapie) avec un débit accru. Les approches précédentes, y compris celle présent…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier spécifiquement Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore et Itay Solomon pour leurs contributions aux itérations précédentes du schéma de photogelation. Les lignées cellulaires GS122 et GS304 ont été généreusement fournies par David Nathanson. Toutes les figurines ont été créées avec BioRender.com. Les installations de base de l’UCLA, les ressources partagées de criblage moléculaire et le laboratoire de caractérisation nano et pico ont joué un rôle déterminant dans le travail. Chen-Chun a été soutenu par le programme de formation Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research de l’UCLA. Grigor Varuzhanyan a été soutenu par un programme de formation en biologie des cellules tumorales NIH Grant (T32 CA 009056).
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |