Matrizes de hidrogel permitem aumento de rendimento para efeitos de triagem de componentes matriciais e terapêuticos em modelos de tumor 3D

Summary

O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.

Abstract

As interações entre matriz celular mediam processos fisiológicos complexos por meio de pistas bioquímicas, mecânicas e geométricas, influenciando mudanças patológicas e respostas terapêuticas. Espera-se que a contabilização dos efeitos matriciais no início do pipeline de desenvolvimento de medicamentos aumente a probabilidade de sucesso clínico de novas terapêuticas. Estratégias baseadas em biomateriais recapitulando microambientes específicos de tecido na cultura celular 3D existem, mas integrar-os com os métodos de cultura 2D usados principalmente para a triagem de medicamentos tem sido desafiador. Assim, o protocolo aqui apresentado detalha o desenvolvimento de métodos para a cultura 3D dentro de matrizes biomateriais miniaturizadas em um formato de placa multi-poço para facilitar a integração com os pipelines de triagem de medicamentos existentes e ensaios convencionais para viabilidade celular. Uma vez que a matriz apresenta características críticas para a preservação de fenótipos clinicamente relevantes em células cultivadas, espera-se que seja altamente específico para tecidos e doenças, a triagem combinatória dos parâmetros matriciais será necessária para identificar condições adequadas para aplicações específicas. Os métodos descritos aqui utilizam um formato de cultura miniaturizada para avaliar as respostas das células cancerosas à variação ortogonal da mecânica matricial e apresentação de ligantes. Especificamente, este estudo demonstra o uso desta plataforma para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais sobre as respostas das células glioblastoma derivadas do paciente (GBM) à quimioterapia.

Introduction

O custo esperado para o desenvolvimento de uma nova droga aumentou constantemente na última década, com mais de US $ 1 bilhão em estimativas atuais¹. Parte dessa despesa é a alta taxa de falha de medicamentos entrando em ensaios clínicos. Aproximadamente 12% dos candidatos a medicamentos finalmente ganham aprovação da Food & Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos (EUA) em 2019. Muitas drogas falham na Fase I devido à toxicidade inesperada², enquanto outras que passam por testes de segurança podem falhar devido à falta de eficácia³. Este atrito devido à não eficácia pode ser explicado em parte pelo fato de que os modelos de câncer usados durante o desenvolvimento de medicamentos são notoriamente não preditivos da eficácia clínica⁴.

Disparidades funcionais entre modelos in vitro e in vivo podem ser atribuídas à remoção de células cancerígenas de seu microambiente nativo, incluindo células não tumorais e o ECM ^5,6 físico. Comumente, grupos de pesquisa usam matrizes culturais disponíveis comercialmente, como Matrigel (uma matriz de membrana de porão protéciosa derivada de sarcomas de camundongos) para fornecer células tumorais cultivadas com um microambiente de matriz 3D. Em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D na matriz de membrana melhorou a relevância clínica dos resultados in vitro ^7,8. No entanto, os biomaterias de cultura de tecidos descelularizados, incluindo a matriz de membrana, normalmente exibem variabilidade em lote que pode comprometer a reprodutibilidade⁹. Além disso, matrizes derivadas de tumores com diferentes origens teciduais dos estudados podem não fornecer as pistas fisiológicas apropriadas¹⁰. Finalmente, os cânceres com altos graus de heterogeneidade intratumoral têm características microambientais que variam em uma escala de tamanho de submicron e que a matriz de membrana não pode ser ajustada para recapitular¹¹.

Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral uniformemente letal com um tempo médio de sobrevida de aproximadamente 15 meses, é um câncer para o qual o desenvolvimento do tratamento tem sido particularmente difícil^12,13. O padrão atual de cuidado para GBM consiste em ressecção do tumor primário, seguido de radioterapia e quimioterapia usando temozolomide (TMZ)¹⁴. No entanto, mais da metade dos tumores clínicos de GBM apresentam resistência ao tratamento através de vários mecanismos 15,16,17. Prever a eficácia de um regime de tratamento para um paciente individual é extremamente difícil. Modelos pré-clínicos padrão usados para prever desfechos individuais consistem em células tumorais derivadas do paciente xenoenxericamente em camundongos imunocomprometidos. Embora os xenoenxertos derivados do paciente possam recapitular muitos aspectos dos tumores clínicos de GBM e são valiosos para modelos pré-clínicos¹⁸, eles são inerentemente caros, de baixa produtividade, demorados e envolvem preocupações éticas¹⁹. Culturas de células derivadas do paciente, em superfícies plásticas 2D ou como esferoides, evitam principalmente esses problemas. Embora as células derivadas do paciente preservem aberrações genéticas, suas culturas em 2D ou como esferoides suspensos têm sido em grande parte representações ruins de xenoenxertos derivados do paciente em roedores e tumores originais^{do paciente 20}. Anteriormente, nós, e outros, mostramos que as células GBM cultivadas em um ECM 3D que imita as propriedades mecânicas e bioquímicas do tecido cerebral podem preservar fenótipos de resistência a drogas 10,21,22,23.

Interações entre o ácido hialurônico (HA), um polissacarídeo abundante no cérebro ECM e superexpresso em tumores GBM, e seu receptor CD44 modulam a aquisição da resistência medicamentosa in vitro 21,24,25,26,27. Por exemplo, a inclusão de HA dentro de culturas 3D suaves aumentou a capacidade das células GBM derivadas do paciente de adquirir resistência terapêutica. Essa mecano-responsividade dependia da vinculação ha aos receptores CD44 em células GBM²¹. Além disso, a ligação integrin aos peptídeos portadores de RGD, incorporadas em matrizes de cultura 3D, amplificou a chemoresistance mediada pelo CD44 de forma dependente da rigidez²¹. Além do HA, a expressão de várias proteínas ECM, muitas contendo regiões de RGD, variam entre tumores cerebrais normais e GBM²⁸. Por exemplo, um estudo relatou que 28 proteínas ECM distintas foram regulamentadas em tumores GBM²⁹. Dentro deste complexo microambiente da matriz tumoral, as células cancerígenas integram sinais mecânicos e bioquímicos para produzir um fenótipo de resistência particular, que depende de diferenças relativamente pequenas (por exemplo, menos de uma ordem de magnitude) no modulo de Young ou densidade de peptídeos integrin-binding 28,29,30.

O presente protocolo caracteriza como as células tumorais interpretam combinações únicas de sinais matriciais e identificam microambientes matriciais complexos e específicos do paciente que promovem a resistência ao tratamento (Figura 1A). Um método fotoquímico para gerar matrizes miniaturizadas e precisamente sintonizadas para a cultura 3D proporciona um espaço variável grande e ortogonal. Uma matriz personalizada de LEDs, executado por um microcontrolador, foi incorporada a hidrogéis fotocrosslink dentro de um formato de placa de 384 poços para aumentar a automação e a reprodutibilidade. A intensidade de exposição foi variada em todo o bem para alterar as propriedades micromecânicas dos hidrogéis resultantes, conforme avaliado por meio de microscopia de força atômica (AFM). Embora este manuscrito não se concentre na construção da matriz de iluminação em si, um diagrama de circuito (Figura 1B) e lista de peças (Tabela de Materiais) são fornecidos como auxílios para a reprodução do dispositivo.

Este relatório demonstra a rápida geração de uma matriz de células GBM cultivadas em microambientes 3D únicos nos quais o módulo de Young (quatro níveis em uma única ordem de magnitude) e o teor de peptídeos integrin (derivados de quatro proteínas ECM diferentes) foram variados ortogonicamente. A abordagem foi então utilizada para investigar as contribuições relativas da mecânica hidrogel e do engajamento integrin específico do ECM na viabilidade e proliferação de células GBM derivadas do paciente à medida que adquirem resistência à quimioterapia temozolomide (TMZ).

Protocol

As linhas celulares GBM derivadas do paciente (GS122 e GS304) foram fornecidas pelo professor David Nathanson (nosso colaborador), que desenvolveu essas linhas sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (IRB nº 10-000655). As células foram fornecidas desidentidas para que as linhas celulares não pudessem ser ligadas aos pacientes individuais. 1. Preparação da solução de hidrogel Prepare a solução tamponada hepes dissolvendo o p…

Representative Results

As medições da AFM confirmaram o controle preciso da mecânica de hidrogel em função da irradiação UV (mW/cm2) durante o photo-crosslinking usando uma matriz LED personalizada, controlada por Arduino (Figura 2A). A formulação de hidrogel utilizada neste protocolo pode ser encontrada na Tabela 2. O espaçamento dos LEDs no modelo fornecido corresponde ao espaçamento para todos os outros poços de uma placa de 384 poços, permitindo a formação de géis de…

Discussion

O trabalho atual apresenta métodos para gerar culturas miniaturizadas em 3D dentro da HA, alterando simultaneamente a rigidez matricial e peptídeos disponíveis para engajamento integrin. Essa técnica permite o estudo sistemático de como os parâmetros matriciais afetam fenótipos celulares (por exemplo, a viabilidade das células cancerígenas expostas à quimioterapia) com aumento do rendimento. Abordagens anteriores, incluindo as aqui apresentadas, têm afinado a rigidez do hidrogel variando a porcentagem de polí…

Materials

1.1 kOhm resistors, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube	Genesse Scientific	21-108
15 mL conical tube	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 well plate	Bio Greiner One	781090
40 µm cell strainer	MTC bio	C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	cell dissociation  reagent
AFM Probes	Novascan		0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifuge	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM – F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous	Fisher Scientific	A405P	Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplement	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µg/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Hot Air Gun	Wagner	HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95%	Sigma Aldrich	900889-1G
Magnetic stir plate	Thermo Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement pipette
Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Plain Microscope Slides	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep	Grace Bio Labs	664201-A	Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing	Processing	3.5.4
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
Repeater Pipette Tips	Sartorious	30089430	1 mL sizes
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Solder Paste	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Plate Reader	Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375