Gli array di idrogel consentono una maggiore produttività per gli effetti di screening dei componenti della matrice e delle terapie nei modelli tumorali 3D

Summary

Il presente protocollo descrive una piattaforma sperimentale per valutare gli effetti dei segnali meccanici e biochimici sulle risposte chemioterapiche delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente in colture 3D matrix-mimetiche utilizzando un dispositivo di illuminazione UV su misura che facilita il fotocrosslinking ad alto rendimento di idrogel con caratteristiche meccaniche sintonizzabili.

Abstract

Le interazioni cellula-matrice mediano processi fisiologici complessi attraverso segnali biochimici, meccanici e geometrici, influenzando i cambiamenti patologici e le risposte terapeutiche. Si prevede che la contabilizzazione degli effetti della matrice nelle prime fasi della pipeline di sviluppo del farmaco aumenterà la probabilità di successo clinico di nuove terapie. Esistono strategie basate su biomateriali che ricapitolano specifici microambienti tissutali in colture cellulari 3D, ma integrarle con i metodi di coltura 2D utilizzati principalmente per lo screening dei farmaci è stata una sfida. Pertanto, il protocollo qui presentato descrive in dettaglio lo sviluppo di metodi per la coltura 3D all’interno di matrici di biomateriali miniaturizzati in un formato di piastra multi-pozzo per facilitare l’integrazione con le pipeline di screening dei farmaci esistenti e i saggi convenzionali per la vitalità cellulare. Poiché si prevede che le caratteristiche della matrice critiche per la conservazione dei fenotipi clinicamente rilevanti nelle cellule coltivate siano altamente specifiche per i tessuti e la malattia, sarà necessario lo screening combinatorio dei parametri della matrice per identificare le condizioni appropriate per applicazioni specifiche. I metodi qui descritti utilizzano un formato di coltura miniaturizzato per valutare le risposte delle cellule tumorali alla variazione ortogonale della meccanica della matrice e della presentazione del ligando. In particolare, questo studio dimostra l’uso di questa piattaforma per studiare gli effetti dei parametri della matrice sulle risposte delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente (GBM) alla chemioterapia.

Introduction

Il costo previsto per lo sviluppo di un nuovo farmaco è aumentato costantemente negli ultimi dieci anni, con oltre $ 1 miliardo nelle stime attuali¹. Parte di questa spesa è l’alto tasso di fallimento dei farmaci che entrano negli studi clinici. Circa il 12% dei farmaci candidati alla fine ottiene l’approvazione dalla Food & Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (USA) nel 2019. Molti farmaci falliscono nella fase I a causa della tossicità imprevista², mentre altri che superano gli studi di sicurezza possono fallire a causa della mancanza di efficacia³. Questo logoramento dovuto alla non efficacia può essere in parte spiegato dal fatto che i modelli di cancro utilizzati durante lo sviluppo del farmaco sono notoriamente non predittivi dell’efficacia clinica⁴.

Le disparità funzionali tra modelli in vitro e in vivo possono essere attribuite alla rimozione delle cellule tumorali dal loro microambiente nativo, comprese le cellule non tumorali e l’ECM fisico ^5,6. Comunemente, i gruppi di ricerca utilizzano matrici di coltura disponibili in commercio, come Matrigel (una matrice di membrana basale proteica derivata da sarcomi di topo) per fornire alle cellule tumorali in coltura un microambiente a matrice 3D. Rispetto alla coltura 2D, la coltura 3D nella matrice di membrana ha migliorato la rilevanza clinica dei risultati in vitro ^7,8. Tuttavia, i biomateriali di coltura da tessuti decellularizzati, compresa la matrice di membrana, in genere mostrano una variabilità da lotto a lotto che può compromettere la riproducibilità⁹. Inoltre, le matrici derivate da tumori con origini tissutali diverse da quelle studiate potrebbero non fornire gli opportuni spunti fisiologici¹⁰. Infine, i tumori con alti gradi di eterogeneità intratumorale hanno caratteristiche microambientali che variano su una scala di dimensioni submicroniche e che la matrice di membrana non può essere sintonizzata per ricapitolare¹¹.

Il glioblastoma (GBM), un tumore cerebrale uniformemente letale con un tempo di sopravvivenza mediano di circa 15 mesi, è un tumore per il quale lo sviluppo del trattamento è stato particolarmente difficile^12,13. L’attuale standard di cura per GBM consiste nella resezione primaria del tumore, seguita dalla radioterapia e quindi dalla chemioterapia con temozolomide (TMZ)¹⁴. Tuttavia, più della metà dei tumori GBM clinici mostra resistenza al trattamento attraverso vari meccanismi 15,16,17. Prevedere l’efficacia di un regime di trattamento per un singolo paziente è estremamente difficile. I modelli preclinici standard utilizzati per prevedere i risultati individuali sono costituiti da cellule tumorali derivate dal paziente che si sono deformate ortotopicamente in topi immunocompromessi. Mentre gli xenotrapianti derivati dal paziente possono ricapitolare molti aspetti dei tumori GBM clinici e sono preziosi per i modelli preclinici¹⁸, sono intrinsecamente costosi, a bassa produttività, richiedono molto tempo e comportano preoccupazioni etiche¹⁹. Le colture di cellule derivate dal paziente, su superfici di plastica 2D o come sferoidi, per lo più evitano questi problemi. Mentre le cellule derivate dal paziente conservano le aberrazioni genetiche, le loro colture in 2D o come sferoidi sospesi sono state in gran parte rappresentazioni scadenti di xenotrapianti derivati dal paziente nei roditori e nei tumori originali dei pazienti²⁰. In precedenza, noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule GBM coltivate in un ECM 3D che imita le proprietà meccaniche e biochimiche del tessuto cerebrale possono preservare i fenotipi di resistenza ai farmaci 10,21,22,23.

Le interazioni tra l’acido ialuronico (HA), un polisaccaride abbondante nell’ECM cerebrale e sovraespresso nei tumori GBM, e il suo recettore CD44 modulano l’acquisizione della resistenza ai farmaci in vitro 21,24,25,26,27. Ad esempio, l’inclusione di HA all’interno di colture 3D morbide ha aumentato la capacità delle cellule GBM derivate dal paziente di acquisire resistenza terapeutica. Questa meccano-responsività dipendeva dal legame dell’HA ai recettori CD44 sulle cellule GBM²¹. Inoltre, il legame dell’integrina ai peptidi portatori di RGD, incorporato in matrici di coltura 3D, ha amplificato la chemioresistenza mediata da CD44 in modo dipendente dalla rigiditಹ. Oltre all’HA, l’espressione di diverse proteine ECM, molte contenenti regioni RGD, varia tra il cervello normale e i tumori GBM²⁸. Ad esempio, uno studio ha riportato che 28 distinte proteine ECM erano sovraregolate nei tumori GBM²⁹. All’interno di questo complesso microambiente a matrice tumorale, le cellule tumorali integrano segnali meccanici e biochimici per produrre un particolare fenotipo di resistenza, che dipende da differenze relativamente piccole (ad esempio, meno di un ordine di grandezza) nel modulo di Young o densità di peptidi leganti l’integrina 28,29,30.

Il presente protocollo caratterizza il modo in cui le cellule tumorali interpretano combinazioni uniche di segnali matriciali e identificano microambienti a matrice complessi e specifici per il paziente che promuovono la resistenza al trattamento (Figura 1A). Un metodo fotochimico per generare matrici miniaturizzate e sintonizzate con precisione per la coltura 3D fornisce un ampio spazio variabile ortogonale. Un array di LED costruito su misura, gestito da un microcontrollore, è stato incorporato per fotocrosslink idrogel all’interno di un formato di piastra a 384 pozzetti per aumentare l’automazione e la riproducibilità. L’intensità dell’esposizione è stata variata in modo variabile per alterare le proprietà micromeccaniche degli idrogel risultanti, come valutato utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre questo manoscritto non si concentra sulla costruzione dell’array di illuminazione stesso, uno schema elettrico (Figura 1B) e un elenco di parti (Tabella dei materiali) sono forniti come ausili per la riproduzione del dispositivo.

Questo rapporto dimostra la rapida generazione di una serie di cellule GBM coltivate in microambienti 3D unici in cui il modulo di Young (quattro livelli in un singolo ordine di grandezza) e il contenuto peptidico legante l’integrina (derivato da quattro diverse proteine ECM) sono stati variati ortogonalmente. L’approccio è stato poi utilizzato per studiare i contributi relativi della meccanica dell’idrogel e dell’impegno dell’integrina specifica dell’ECM sulla vitalità e la proliferazione delle cellule GBM derivate dal paziente mentre acquisiscono resistenza alla chemioterapia temozolomide (TMZ).

Protocol

Le linee cellulari GBM derivate dal paziente (GS122 e GS304) sono state fornite dal professor David Nathanson (nostro collaboratore), che ha sviluppato queste linee secondo un protocollo approvato dall’UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Le cellule sono state fornite de-identificate in modo che le linee cellulari non potessero essere ricollegate ai singoli pazienti. 1. Preparazione della soluzione di idrogel Preparare la soluzione tamponata con HEPES s…

Representative Results

Le misurazioni AFM hanno confermato il controllo preciso della meccanica dell’idrogel in funzione dell’irraggiamento UV (mW/cm2) durante la fotorelazione utilizzando un array di LED personalizzato e controllato da Arduino (Figura 2A). La formulazione in idrogel utilizzata in questo protocollo può essere trovata nella Tabella 2. La spaziatura dei LED sul modello fornito corrisponde alla spaziatura per ogni altro pozzo di una piastra a 384 pozzetti, consentendo la …

Discussion

Il lavoro attuale presenta metodi per generare colture miniaturizzate 3D all’interno di HA, alterando contemporaneamente la rigidità della matrice e i peptidi disponibili per l’impegno dell’integrina. Questa tecnica consente lo studio sistematico di come i parametri della matrice influenzano i fenotipi cellulari (ad esempio, la vitalità delle cellule tumorali esposte alla chemioterapia) con una maggiore produttività. Gli approcci precedenti, incluso quello qui presentato, hanno regolato la rigidità dell’idrogel varia…

Materials

1.1 kOhm resistors, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube	Genesse Scientific	21-108
15 mL conical tube	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 well plate	Bio Greiner One	781090
40 µm cell strainer	MTC bio	C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	cell dissociation  reagent
AFM Probes	Novascan		0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifuge	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM – F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous	Fisher Scientific	A405P	Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplement	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µg/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Hot Air Gun	Wagner	HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95%	Sigma Aldrich	900889-1G
Magnetic stir plate	Thermo Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement pipette
Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Plain Microscope Slides	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep	Grace Bio Labs	664201-A	Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing	Processing	3.5.4
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
Repeater Pipette Tips	Sartorious	30089430	1 mL sizes
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Solder Paste	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Plate Reader	Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375