Hydrogel arrays möjliggör ökad genomströmning för screeningeffekter av matriskomponenter och terapier i 3D-tumörmodeller
Summary
Detta protokoll beskriver en experimentell plattform för att bedöma effekterna av mekaniska och biokemiska ledtrådar på kemoterapeutiska svar från patient-härledda glioblastomceller i 3D-matris-mimetiska kulturer med hjälp av en skräddarsydd UV-belysningsanordning som underlättar fotokorslänkning med hög genomströmning av hydrogeler med avstämbara mekaniska egenskaper.
Abstract
Cellmatrisinteraktioner förmedlar komplexa fysiologiska processer genom biokemiska, mekaniska och geometriska ledtrådar, vilket påverkar patologiska förändringar och terapeutiska svar. Redovisning av matriseffekter tidigare i läkemedelsutvecklingspipelinen förväntas öka sannolikheten för klinisk framgång för nya terapier. Biomaterialbaserade strategier som rekapitulerar specifika vävnadsmikromiljöer i 3D-cellodling finns men att integrera dessa med de 2D-odlingsmetoder som främst används för läkemedelsscreening har varit utmanande. Således beskriver protokollet som presenteras här utvecklingen av metoder för 3D-odling inom miniatyriserade biomaterialmatriser i ett flerbrunnsplattformat för att underlätta integration med befintliga läkemedelsscreeningsrörledningar och konventionella analyser för cellviabilitet. Eftersom matrisens egenskaper som är kritiska för att bevara kliniskt relevanta fenotyper i odlade celler förväntas vara mycket vävnads- och sjukdomsspecifika, kommer kombinatorisk screening av matrisparametrar att vara nödvändig för att identifiera lämpliga förhållanden för specifika tillämpningar. Metoderna som beskrivs här använder ett miniatyriserat odlingsformat för att bedöma cancercellsvar på ortogonal variation av matrismekanik och ligandpresentation. Specifikt visar denna studie användningen av denna plattform för att undersöka effekterna av matrisparametrar på svaren från patient-härledda glioblastom (GBM) celler till kemoterapi.
Introduction
Den förväntade kostnaden för att utveckla ett nytt läkemedel har stadigt ökat under det senaste decenniet, med över 1 miljard dollar i nuvarande uppskattningar1. En del av denna kostnad är den höga felfrekvensen för läkemedel som går in i kliniska prövningar. Cirka 12% av läkemedelskandidaterna får slutligen godkännande från USA (US) Food &Drug Administration (FDA) under 2019. Många läkemedel misslyckas i fas I på grund av oväntad toxicitet2, medan andra som klarar säkerhetsstudier kan misslyckas på grund av brist på effekt3. Denna förslitning på grund av bristande effekt kan delvis förklaras av det faktum att cancermodeller som används under läkemedelsutveckling är notoriskt icke-prediktiva för klinisk effekt4.
Funktionella skillnader mellan in vitro- och in vivo-modeller kan hänföras till att cancerceller avlägsnas från deras ursprungliga mikromiljö, inklusive icke-tumörceller och den fysiska ECM 5,6. Vanligtvis använder forskargrupper kommersiellt tillgängliga odlingsmatriser, såsom Matrigel (en proteinhaltig källarmembranmatris härledd från mussarkom) för att ge odlade tumörceller en 3D-matrismikromiljö. Jämfört med 2D-odling har 3D-odling i membranmatris förbättrat den kliniska relevansen av in vitro-resultat 7,8. Odlingsbiomaterial från decellulariserade vävnader, inklusive membranmatrisen, uppvisar emellertid vanligtvis batch-till-batch-variabilitet som kan äventyrareproducerbarheten 9. Dessutom kan matriser som härrör från tumörer med olika vävnadsursprung än de studerade kanske inte ge lämpliga fysiologiska ledtrådar10. Slutligen har cancer med höga grader av intratumoral heterogenitet mikromiljöegenskaper som varierar på en submikronstorleksskala och som membranmatrisen inte kan ställas in för att rekapitulera11.
Glioblastom (GBM), en enhetligt dödlig hjärntumör med en medianöverlevnadstid på cirka 15 månader, är en cancer för vilken behandlingsutvecklingen har varit särskilt svår 12,13. Den nuvarande vårdstandarden för GBM består av primär tumörresektion, följt av strålbehandling, och sedan kemoterapi med temozolomid (TMZ)14. Ändå uppvisar mer än hälften av kliniska GBM-tumörer behandlingsresistens genom olika mekanismer 15,16,17. Att förutsäga effekten av en behandlingsregim för en enskild patient är extremt svårt. Standard prekliniska modeller som används för att förutsäga individuella utfall består av patient-härledda tumörceller xenograferade ortotopiskt till immunkomprometterade möss. Medan patient-härledda xenografter kan rekapitulera många aspekter av kliniska GBM-tumörer och är värdefulla för prekliniska modeller18, är de i sig dyra, låg genomströmning, tidskrävande och involverar etiska problem19. Kulturer av patient-härledda celler, på 2D-plastytor eller som sfäroider, undviker oftast dessa problem. Medan patient-härledda celler bevarar genetiska avvikelser, har deras kulturer i 2D eller som suspenderade sfäroider till stor del varit dåliga representationer av patient-härledda xenografter hos gnagare och ursprungliga patienttumörer20. Tidigare har vi, och andra, visat att GBM-celler odlade i en 3D ECM som efterliknar de mekaniska och biokemiska egenskaperna hos hjärnvävnad kan bevara läkemedelsresistensfenotyper 10,21,22,23.
Interaktioner mellan hyaluronsyra (HA), en polysackarid som är riklig i hjärnan ECM och överuttryckt i GBM-tumörer, och dess CD44-receptor modulerar förvärvet av läkemedelsresistens in vitro 21,24,25,26,27. Till exempel ökade inkluderingen av HA i mjuka 3D-kulturer förmågan hos patient-härledda GBM-celler att förvärva terapeutisk resistens. Denna mekano-responsivitet var beroende av HA-bindning till CD44-receptorer på GBM-celler21. Dessutom förstärkte integrinbindning till RGD-bärande peptider, införlivade i 3D-odlingsmatriser, CD44-medierad kemoresistans på ett styvhetsberoende sätt21. Utöver HA varierar uttrycket av flera ECM-proteiner, många innehållande RGD-regioner, mellan normal hjärna och GBM-tumörer28. Till exempel rapporterade en studie att 28 distinkta ECM-proteiner uppreglerades i GBM-tumörer29. Inom denna komplexa tumörmatrismikromiljö integrerar cancerceller mekaniska och biokemiska ledtrådar för att ge en viss resistensfenotyp, vilket beror på relativt små skillnader (t.ex. mindre än en storleksordning) i Youngs modul eller densitet av integrinbindande peptider 28,29,30.
Det aktuella protokollet karakteriserar hur tumörceller tolkar unika kombinationer av matrissignaler och identifierar komplexa, patientspecifika matrismikromiljöer som främjar behandlingsresistens (Figur 1A). En fotokemisk metod för att generera miniatyriserade, exakt avstämda matriser för 3D-kultur ger ett stort, ortogonalt variabelt utrymme. En specialbyggd uppsättning lysdioder, som drivs av en mikrokontroller, införlivades med fotocrosslänkhydrogeler i ett 384-brunnsplattformat för att öka automatiseringen och reproducerbarheten. Exponeringsintensiteten varierades över brunnen för att ändra mikromekaniska egenskaper hos resulterande hydrogeler, enligt bedömning med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM). Även om detta manuskript inte fokuserar på att konstruera själva belysningsuppsättningen, tillhandahålls ett kretsschema (figur 1B) och en reservdelslista (materialtabell) som hjälpmedel för enhetsreproduktion.
Denna rapport visar den snabba genereringen av en rad GBM-celler odlade i unika 3D-mikromiljöer där Youngs modul (fyra nivåer över en enda storleksordning) och integrinbindande peptidinnehåll (härledd från fyra olika ECM-proteiner) varierades ortogonalt. Metoden användes sedan för att undersöka de relativa bidragen från hydrogelmekanik och ECM-specifikt integrinengagemang på livskraften och spridningen av patient-härledda GBM-celler när de förvärvar resistens mot temozolomid (TMZ) kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det aktuella arbetet presenterar metoder för att generera 3D, miniatyriserade kulturer inom HA-baserade samtidigt som matrisstyvhet och peptider som är tillgängliga för integrinengagemang förändras. Denna teknik möjliggör systematisk studie av hur matrisparametrar påverkar cellulära fenotyper (t.ex. livskraften hos cancerceller som utsätts för kemoterapi) med ökad genomströmning. Tidigare tillvägagångssätt, inklusive det som presenteras här, har justerat hydrogelstyvheten genom att variera procenten tot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill särskilt uppmärksamma Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore och Itay Solomon för deras bidrag till tidigare iterationer av fotogelationsschemat. Cellinjerna GS122 och GS304 tillhandahölls generöst av David Nathanson. Alla figurer skapades med BioRender.com. UCLA-kärnfaciliteter, Molecular Screening Shared Resources och Nano and Pico Characterization Laboratory var avgörande för arbetet. Chen Chia-Chun stöddes av UCLA Eli och Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan stöddes av ett tumörcellbiologiskt träningsprogram NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
