Les réseaux d’hydrogel permettent d’augmenter le débit pour le dépistage des effets des composants matriciels et des thérapies dans les modèles tumoraux 3D

Summary

Le présent protocole décrit une plate-forme expérimentale pour évaluer les effets des signaux mécaniques et biochimiques sur les réponses chimiothérapeutiques des cellules de glioblastome dérivées de patients dans des cultures mimétiques matricielles 3D à l’aide d’un dispositif d’éclairage UV sur mesure facilitant la photocroision à haut débit d’hydrogels avec des caractéristiques mécaniques accordables.

Abstract

Les interactions cellule-matrice interviennent dans des processus physiologiques complexes par le biais d’indices biochimiques, mécaniques et géométriques, influençant les changements pathologiques et les réponses thérapeutiques. La prise en compte des effets matriciels plus tôt dans le développement de médicaments devrait augmenter la probabilité de succès clinique de nouveaux traitements. Il existe des stratégies basées sur les biomatériaux récapitulant des microenvironnements tissulaires spécifiques en culture cellulaire 3D, mais leur intégration avec les méthodes de culture 2D principalement utilisées pour le dépistage des drogues a été difficile. Ainsi, le protocole présenté ici détaille le développement de méthodes de culture 3D au sein de matrices de biomatériaux miniaturisés dans un format de plaque multi-puits pour faciliter l’intégration avec les pipelines de dépistage de médicaments existants et les tests conventionnels pour la viabilité cellulaire. Étant donné que les caractéristiques matricielles essentielles à la préservation des phénotypes cliniquement pertinents dans les cellules cultivées devraient être hautement spécifiques aux tissus et aux maladies, un dépistage combinatoire des paramètres de la matrice sera nécessaire pour identifier les conditions appropriées pour des applications spécifiques. Les méthodes décrites ici utilisent un format de culture miniaturisé pour évaluer les réponses des cellules cancéreuses à la variation orthogonale de la mécanique matricielle et à la présentation des ligands. Plus précisément, cette étude démontre l’utilisation de cette plate-forme pour étudier les effets des paramètres de matrice sur les réponses des cellules de glioblastome dérivées du patient (GBM) à la chimiothérapie.

Introduction

Le coût prévu du développement d’un nouveau médicament n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière décennie, avec plus de 1 milliard de dollars dans les estimations actuelles¹. Une partie de cette dépense est due au taux élevé d’échec des médicaments entrant dans les essais cliniques. Environ 12% des candidats médicaments ont finalement obtenu l’approbation de la Food & Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019. De nombreux médicaments échouent en phase I en raison d’une toxicité imprévue², tandis que d’autres qui réussissent les essais de sécurité peuvent échouer en raison d’un manque d’efficacité³. Cette attrition due à la non-efficacité peut s’expliquer en partie par le fait que les modèles de cancer utilisés lors du développement de médicaments sont notoirement non prédictifs de l’efficacité clinique⁴.

Les disparités fonctionnelles entre les modèles in vitro et in vivo peuvent être attribuées à l’élimination des cellules cancéreuses de leur microenvironnement natif, y compris les cellules non tumorales et l’ECM^{physique 5,6}. Généralement, les groupes de recherche utilisent des matrices de culture disponibles dans le commerce, telles que Matrigel (une matrice de membrane basale protéinée dérivée de sarcomes de souris) pour fournir aux cellules tumorales cultivées un microenvironnement matriciel 3D. Par rapport à la culture 2D, la culture 3D dans une matrice membranaire a amélioré la pertinence clinique des résultats in vitro ^7,8. Cependant, les biomatériaux de culture à partir de tissus décellularisés, y compris la matrice membranaire, présentent généralement une variabilité d’un lot à l’autre qui peut compromettre la reproductibilité⁹. En outre, les matrices dérivées de tumeurs d’origine tissulaire différente de celles étudiées peuvent ne pas fournir les indices physiologiques appropriés¹⁰. Enfin, les cancers à haut degré d’hétérogénéité intratumorale ont des caractéristiques microenvironnementales qui varient sur une échelle submicronique et que la matrice membranaire ne peut pas être réglée pour récapituler¹¹.

Le glioblastome (GBM), une tumeur cérébrale uniformément mortelle avec un temps de survie médian d’environ 15 mois, est un cancer pour lequel le développement du traitement a été particulièrement difficile^12,13. La norme actuelle de soins pour le GBM consiste en une résection de la tumeur primaire, suivie d’une radiothérapie, puis d’une chimiothérapie à l’aide de témozolomide (TMZ)¹⁴. Pourtant, plus de la moitié des tumeurs CLINIQUES GBM présentent une résistance au traitement par divers mécanismes 15,16,17. Il est extrêmement difficile de prédire l’efficacité d’un schéma thérapeutique pour un patient individuel. Les modèles précliniques standard utilisés pour prédire les résultats individuels consistent en des cellules tumorales dérivées de patients xénogreffées orthotopiquement dans des souris immunodéprimées. Bien que les xénogreffes dérivées du patient puissent récapituler de nombreux aspects des tumeurs cliniques GBM et soient précieuses pour les modèles précliniques¹⁸, elles sont intrinsèquement coûteuses, à faible débit, prennent beaucoup de temps et impliquent des préoccupations éthiques¹⁹. Les cultures de cellules dérivées de patients, sur des surfaces en plastique 2D ou sous forme de sphéroïdes, évitent généralement ces problèmes. Alors que les cellules dérivées de patients préservent les aberrations génétiques, leurs cultures en 2D ou sous forme de sphéroïdes en suspension ont été en grande partie de mauvaises représentations de xénogreffes dérivées de patients chez des rongeurs et des tumeurs originales^{de patients 20}. Auparavant, nous, et d’autres, avons montré que les cellules GBM cultivées dans un ECM 3D qui imite les propriétés mécaniques et biochimiques du tissu cérébral peuvent préserver les phénotypes de résistance aux médicaments 10,21,22,23.

Les interactions entre l’acide hyaluronique (HA), un polysaccharide abondant dans l’ECM cérébral et surexprimé dans les tumeurs GBM, et son récepteur CD44 modulent l’acquisition de la résistance aux médicaments in vitro ^{21,24,25,26,27}. Par exemple, l’inclusion de l’AH dans des cultures 3D molles a augmenté la capacité des cellules GBM dérivées du patient à acquérir une résistance thérapeutique. Cette mécano-réceptivité dépendait de la liaison de l’AH aux récepteurs CD44 sur les cellules GBM²¹. De plus, la liaison de l’intégrine aux peptides porteurs de RGD, incorporée dans des matrices de culture 3D, a amplifié la chimiorésistance médiée par CD44 d’une manière dépendante de la rigidité²¹. Au-delà de l’AH, l’expression de plusieurs protéines ECM, dont beaucoup contiennent des régions RGD, varie entre le cerveau normal et les tumeurs GBM²⁸. Par exemple, une étude a rapporté que 28 protéines ECM distinctes étaient régulées à la hausse dans les tumeurs GBM²⁹. Dans ce microenvironnement complexe de la matrice tumorale, les cellules cancéreuses intègrent des indices mécaniques et biochimiques pour produire un phénotype de résistance particulier, qui dépend de différences relativement faibles (par exemple, moins d’un ordre de grandeur) dans le module de Young ou la densité des peptides liant l’intégrine 28,29,30.

Le présent protocole caractérise la façon dont les cellules tumorales interprètent des combinaisons uniques d’indices matriciels et identifient des microenvironnements matriciels complexes et spécifiques au patient qui favorisent la résistance au traitement (Figure 1A). Une méthode photochimique pour générer des matrices miniaturisées et réglées avec précision pour la culture 3D fournit un grand espace variable orthogonal. Une gamme de LED sur mesure, gérée par un microcontrôleur, a été incorporée aux hydrogels de photocroisillon dans un format de plaque à 384 puits pour augmenter l’automatisation et la reproductibilité. L’intensité de l’exposition a varié d’un puits à l’autre pour modifier les propriétés micromécaniques des hydrogels résultants, telles qu’évaluées à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Bien que ce manuscrit ne se concentre pas sur la construction du réseau d’éclairage lui-même, un schéma de circuit (Figure 1B) et une liste de pièces (Table des matériaux) sont fournis comme aides à la reproduction de l’appareil.

Ce rapport démontre la génération rapide d’un ensemble de cellules GBM cultivées dans des microenvironnements 3D uniques dans lesquels le module de Young (quatre niveaux sur un seul ordre de grandeur) et la teneur en peptides liant l’intégrine (dérivés de quatre protéines ECM différentes) ont varié orthogonalement. L’approche a ensuite été utilisée pour étudier les contributions relatives de la mécanique de l’hydrogel et de l’engagement de l’intégrine spécifique à l’ECM sur la viabilité et la prolifération des cellules GBM dérivées du patient à mesure qu’elles acquièrent une résistance à la chimiothérapie au témozolomide (TMZ).

Protocol

Les lignées cellulaires GBM dérivées du patient (GS122 et GS304) ont été fournies par le professeur David Nathanson (notre collaborateur), qui a développé ces lignées selon un protocole approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de l’UCLA (IRB # 10-000655). Les cellules ont été anonymisées afin que les lignées cellulaires ne puissent pas être reliées aux patients individuels. 1. Préparation de la solution d’hydrogel Préparer la solution ta…

Representative Results

Les mesures AFM ont confirmé un contrôle précis de la mécanique de l’hydrogel en fonction de l’irradiance UV (mW/cm2) lors de la photo-réticulation à l’aide d’un réseau de LED personnalisé contrôlé par Arduino (Figure 2A). La formulation d’hydrogel utilisée dans ce protocole se trouve dans le tableau 2. L’espacement des LED sur le gabarit fourni correspond à l’espacement pour tous les autres puits d’une plaque de 384 puits, ce qui perme…

Discussion

Les travaux actuels présentent des méthodes pour générer des cultures miniaturisées 3D à base d’AH tout en modifiant simultanément la rigidité de la matrice et les peptides disponibles pour l’engagement de l’intégrine. Cette technique permet d’étudier systématiquement comment les paramètres de la matrice affectent les phénotypes cellulaires (par exemple, la viabilité des cellules cancéreuses exposées à la chimiothérapie) avec un débit accru. Les approches précédentes, y compris celle présent…

Materials

1.1 kOhm resistors, 6 W	Digikey	35601k1ft
1.7 mL microcentrifuge tube	Genesse Scientific	21-108
15 mL conical tube	Fisher Scientific	14-959-70C
365 nm LED	Digikey	ltpl-c034uvh365
384 well plate	Bio Greiner One	781090
40 µm cell strainer	MTC bio	C4040
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa)	Laysan Bio	4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTs	Digikey	2n5550ta
80 Ohm resistors, 0.125 W	Digikey	erjj-6enf80r6v
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa)	Jenkem Technology	A7025-1
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104500	cell dissociation  reagent
AFM Probes	Novascan		0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle
Arduino IDE	Arduino	1.8.19
Arduino Nano	Makerfire	Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CCK8	Abcam	ab228554
Centrifuge	Thermoscientific	sorvall legend xtr
CP100ST	Gilson	F148415	Pipette tips for positive displacement pipette
Cubis Semi-Micro Balance	Sartorius	MSA225S100DI
DMEM – F12 (50-50)	Life Technologies	11330057	1x
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)	Genesse Scientific	25-508
EGF	Peprotech	AF100-15	50 ng/mL
Ethanol, Anhydrous	Fisher Scientific	A405P	Add DI water to dilute to 70%
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials	Fisher Scientific	03-339-23C
Fisherbrand Weighing Paper	Fisher Scientific	09-898-12B
G21 Supplement	Gemini Bio	400-160	50x
Hanks Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175095
HCl, ACS, 12M	Sigma Aldrich	S25838A	Add DI water to dilute to 1 M
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H3149-100Ku	25 µg/mL
HEPES	Sigma Aldrich	H7006-100G
Hot Air Gun	Wagner	HT1000
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95%	Sigma Aldrich	900889-1G
Magnetic stir plate	Thermo Scientific	SP194715
Microcentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall legend micro 21R
Microman E single Channel Pipettor	Gilson	FD10004	Positive displacement pipette
Micropipette Tips	Various Manufacturs		Various sizes
mLine micropipette	Sartorious
N-acetyl Cysteine	Sigma Aldrich	A7250-10G
Nanowizard 4	Bruker		AFM microscope
NaOH	Fisher Scientific	ss255-1	Add DI water to dilute to 1 M
Normoicin	Invivogen	ant-nr-1	500x
Osteopontin Peptide	Genscript	Custom Order	GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
Pipet Aid	Drummond	4000102
Plain Microscope Slides	Globe Scientific	1301
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep	Grace Bio Labs	664201-A	Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet
Processing	Processing	3.5.4
Repeater M4	Eppendorf	4982000322
Repeater Pipette Tips	Sartorious	30089430	1 mL sizes
RGD Peptide	Genscript		GCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serological Pipettes	Genesse Scientific	12-102,12-104	5,10 mL Pipettes
Solder Paste	Digikey	315-NC191LT15T5-ND
Solder Wire
Straight dissecting forceps	VWR Scientific	82027-408
Synergy H1 Plate Reader	Biotek
T-75 Cell Culture Treated Flask	Genesee Scientific	25-209
Temozolomide	Sigma Aldrich	T2577	Typically used from 10 µM to 100 µM
Tenascin-C Peptide	Genscript		GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified	Lifecore Biomedical	HA700K5
VWR Spinbar, Flea Micro	VWR	58948-375