标签保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记
Summary
展示了标签保留扩展显微镜（LR-ExM）的方案。LR-ExM使用一组新颖的三功能锚点，与之前引入的扩展显微镜相比，它提供了更好的标记效率。
Abstract
膨胀显微镜（ExM）是一种样品制备技术，可以与大多数光学显微镜方法结合使用以提高分辨率。将细胞或组织包埋在可溶胀的水凝胶中后，与原始尺寸相比，样品可以物理扩展三到十六倍（线性尺寸）。因此，任何显微镜的有效分辨率都会因膨胀系数而增加。先前引入的ExM的一个主要限制是聚合和消化过程后的荧光降低。为了克服这一限制，已经开发了标签保留扩展显微镜（LR-ExM），它使用一组新型的三功能锚点来防止信号损失并大大提高标记效率。该技术允许人们在纳米级研究细胞或亚细胞结构时实现更高的分辨率，同时将荧光信号损失降至最低。LR-ExM不仅可以用于免疫荧光标记，还可以与自标记蛋白标签（如SNAP-和CLIP-标签）一起使用，从而实现更高的标记效率。这项工作介绍了这种基于免疫染色的方法的程序和故障排除，以及LR-ExM作为替代方案的自标记标记方法的讨论。
Introduction
扩展显微镜（ExM）自首次作为传统显微镜（如落射荧光和共聚焦显微镜1，2，3，4，5，6，7）实现超分辨率成像的便捷方法而引入以来，就已被研究人员使用.使用ExM，即使使用常规共聚焦显微镜也可以实现~70 nm的横向分辨率。当ExM与超分辨率成像相结合时，分辨率会进一步提高。例如，使用结构照明显微镜 （SIM） 可以实现大约 30 nm 的分辨率，使用随机光学重建显微镜 （STORM） 可以实现大约 4 nm 的分辨率1，5。
然而，低标记效率是标准ExM方法的一个关键问题。荧光损失可能因荧光基团的类型和消化时间而异。然而，据报道，平均而言，在ExM的聚合和蛋白质消化步骤之后，超过50%的荧光团丢失，这对成像质量不利3，4。
因此，已经开发了标签保留扩展显微镜（LR-ExM），它可以有效地保留标签并减少信号损失1。LR-ExM的关键创新是使用一组三功能锚，而不是仅仅使用荧光染料 – 如标准ExM程序 – 用于对感兴趣的蛋白质进行染色。这些三官能团接头由三部分组成：（1）连接到抗体的连接器（例如，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）），（2）锚定（例如，甲基丙烯酰胺（MA））将蛋白质锚定到聚合物上，以及（3）报告基因（例如，生物素或地高辛（DIG））与有机染料偶联。三官能团锚在聚合和蛋白质消化步骤中存活，因此可防止荧光团损失。
此外，该方法具有巨大的潜力，因为它与自标记的酶标签（如SNAP或CLIP）兼容。与免疫染色方法相比，酶标签方法在高特异性和标记效率方面具有一些优势8，9，10。
在本手稿中，演示了LR-ExM的详细程序。LR-ExM是一种高效且灵活的方法，可实现高空间分辨率和增强的标记效率。
Protocol
Representative Results
Discussion
LR-ExM的关键创新是使用三功能锚点有效地标记目标蛋白并提高图像质量。这种方法受到三功能锚的限制，研究人员并不容易获得三功能锚。然而，三功能锚可以根据要求与其他研究人员共享，类似的产品，如Chrometa的ExM探针现在也可以商业化。
在该协议中，一抗和二抗染色步骤已在室温下孵育1小时。然而，这些步骤也可以在4°C下过夜，并且观察到过夜染色降低了背景噪音。<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R00 GM126136至X.S.），美国国家科学基金会（DMS1763272至S.P.）和西蒙斯基金会（594598至S.P.）的支持。
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
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