Etiket Tutma Genişletme Mikroskobu (LR-ExM), Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Yüksek Verimli Etiketleme Sağlar
Summary
Bir etiket tutma genişletme mikroskobu protokolü (LR-ExM) gösterilmiştir. LR-ExM, daha önce tanıtılan genleşme mikroskopilerine kıyasla daha iyi etiketleme verimliliği sağlayan yeni bir üç işlevli ankraj seti kullanır.
Abstract
Genleşme mikroskobu (ExM), çözünürlüğü artırmak için çoğu ışık mikroskobu yöntemiyle birleştirilebilen bir numune hazırlama tekniğidir. Hücreleri veya dokuları şişirilebilir hidrojele gömdükten sonra, numuneler orijinal boyuta kıyasla fiziksel olarak üç ila on altı kat (doğrusal boyut) genişletilebilir. Bu nedenle, herhangi bir mikroskobun etkili çözünürlüğü genişleme faktörü ile arttırılır. Daha önce tanıtılan ExM’nin önemli bir sınırlaması, polimerizasyon ve sindirim prosedüründen sonra floresanın azaltılmasıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, sinyal kaybını önleyen ve bir dizi yeni üç işlevli ankraj kullanarak etiketleme verimliliğini büyük ölçüde artıran etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir. Bu teknik, nanometrik ölçekte hücresel veya hücre altı yapıları araştırırken minimum floresan sinyal kaybı ile daha yüksek çözünürlük elde edilmesini sağlar. LR-ExM sadece immünofloresan etiketleme için değil, aynı zamanda SNAP ve CLIP etiketleri gibi kendinden etiketli protein etiketleriyle de kullanılabilir, böylece daha yüksek etiketleme verimliliği elde edilir. Bu çalışma, bu immün boyama temelli yaklaşım için prosedür ve sorun gidermenin yanı sıra LR-ExM’nin kendi kendini etiketleme yaklaşımlarının alternatif olarak tartışılmasını sunmaktadır.
Introduction
Genleşme mikroskobu (ExM), epifloresan ve konfokal mikroskoplargibi geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için uygun bir yaklaşım olarak ilk kez tanıtıldığından beri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6,7 . ExM kullanarak, düzenli konfokal mikroskoplarla bile ~ 70 nm yanal çözünürlük elde etmek mümkündür. ExM, süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildiğinde, çözünürlük daha da geliştirilir. Örneğin, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile kabaca 30 nm çözünürlüğe ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) 1,5 ile kabaca 4 nm çözünürlüğe ulaşılabilir.
Bununla birlikte, düşük etiketleme verimliliği, standart ExM yöntemleriyle ilgili kritik bir konudur. Floresan kaybı, floresan gruplarının türüne ve sindirim süresine bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, ortalama olarak, ExM’nin polimerizasyonundan ve protein sindirim adımlarından sonra floroforların% 50’sinden fazlasının kaybolduğu ve bunun görüntüleme kalitesine zarar verdiği bildirilmiştir 3,4.
Böylece, etiketleri verimli bir şekilde tutabilen ve sinyal kaybını azaltabilen etiket tutma genleşme mikroskobu (LR-ExM) geliştirilmiştir1. LR-ExM’in temel yeniliği, ilgilenilen proteinleri boyamak için standart ExM prosedüründe olduğu gibi sadece floresan boyalar kullanmak yerine bir dizi üç fonksiyonlu ankrajın kullanılmasıdır. Bu üç fonksiyonlu bağlayıcılar üç bölümden oluşur: (1) antikora bağlanmak için konektör (örneğin, N-hidroksisüksinamid (NHS)), (2) proteinleri polimere sabitlemek için çapa (örneğin, metakrilamit (MA)) ve (3) organik bir boyaya konjuge etmek için muhabir (örneğin, biyotin veya digoxigenin (DIG)). Üç fonksiyonlu ankrajlar polimerizasyon ve protein sindirim adımlarında hayatta kalır ve bu nedenle florofor kaybını önler.
Ayrıca, bu yöntem SNAP veya CLIP gibi kendi kendini etiketleyen enzimatik etiketlerle uyumlu olduğu için büyük bir potansiyele sahiptir. Enzimatik etiket yaklaşımlarının immün boyama yaklaşımına göre yüksek özgüllük ve etiketleme verimliliğiaçısından bazı faydaları vardır 8,9,10.
Bu yazıda LR-ExM’in ayrıntılı bir prosedürü gösterilmiştir. LR-ExM, gelişmiş etiketleme verimliliği ile yüksek uzamsal çözünürlük elde etmek için son derece etkili ve esnek bir yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
LR-ExM’in temel yeniliği, hedef proteinleri etkili bir şekilde etiketlemek ve görüntü kalitesini artırmak için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanmaktır. Bu yöntem, araştırmacılar için çok kolay bulunmayan üç işlevli çapalarla sınırlıdır. Bununla birlikte, trifonksiyonel çapalar talep üzerine diğer araştırmacılarla paylaşılabilir ve Chrometa’nın ExM probları gibi benzer ürünler artık ticari olarak da temin edilebilir.
Bu protokolde primer ve sekonder antikor bo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R00 GM126136 – X.S.), ABD Ulusal Bilim Vakfı (DMS1763272 – S.P.) ve Simons Vakfı (594598 S.P.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
