Summary
ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)のプロトコルが実証されています。LR-ExMは、以前に導入された膨張顕微鏡と比較して、より優れたラベリング効率を提供する新しい三官能アンカーのセットを使用しています。
Abstract
膨張顕微鏡(ExM)は、ほとんどの光学顕微鏡法と組み合わせて分解能を高めることができるサンプル調製技術です。細胞または組織を膨潤性ヒドロゲルに包埋した後、サンプルは元のサイズと比較して物理的に3〜16倍(直線寸法)に拡大することができる。したがって、顕微鏡の有効分解能は膨張係数によって増加します。先に導入されたExMの主な制限は、重合および消化手順後の蛍光の減少である。この制限を克服するために、新しい三官能アンカーのセットを使用して信号損失を防ぎ、標識効率を大幅に向上させるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました。この技術により、蛍光シグナル損失を最小限に抑えながら、ナノメートルスケールで細胞または細胞内構造を調べる際に、より高い分解能を達成することができます。LR-ExMは、免疫蛍光標識だけでなく、SNAPタグやCLIPタグなどの自己標識タンパク質タグにも使用できるため、より高い標識効率を実現します。この研究では、この免疫染色ベースのアプローチの手順とトラブルシューティング、および代替としてのLR-ExMの自己標識タグ付けアプローチについて説明します。
Introduction
膨張顕微鏡(ExM)は、落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡などの従来の顕微鏡で超解像イメージングを実現するための便利なアプローチとして最初に導入されて以来、研究者によって使用されてきました1,2,3,4,5,6,7 .ExMを使用すると、通常の共焦点顕微鏡でも~70nmの横方向の分解能を達成することができます。ExMを超解像イメージングと組み合わせると、解像度がさらに向上します。例えば、構造化照明顕微鏡(SIM)では約30nmの分解能、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)では約4nmの分解能を達成できます1,5。
ただし、ラベリング効率の低さは、標準的なExMメソッドでは重要な問題です。蛍光損失は、蛍光基の種類および消化時間に基づいて変化し得る。しかし、平均して、蛍光色素の50%以上がExMの重合およびタンパク質消化ステップの後に失われることが報告されており、これはイメージング品質に有害です3,4。
そのため、ラベルを効率的に保持し、シグナル損失を低減できるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました1。LR-ExMの主な革新は、目的のタンパク質を染色するために、標準的なExM手順のように蛍光色素を単に使用するのではなく、三官能性アンカーのセットを使用することです。これらの三官能性リンカーは、(1)抗体に接続するためのコネクター(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS))、(2)タンパク質をポリマーにアンカーするためのアンカー(例えば、メタクリルアミド(MA))、および(3)有機色素に結合するためのレポーター(例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン(DIG))の3つの部分からなる。三官能性アンカーは、重合およびタンパク質消化ステップに耐え、蛍光色素の損失を防ぎます。
さらに、この方法は、SNAPやCLIPなどの自己標識酵素タグと互換性があるため、大きな可能性を秘めています。酵素タグアプローチは、高い特異性と標識効率に関して免疫染色アプローチに比べていくつかの利点があります8、9、10。
この原稿では、LR-ExMの詳細な手順を示しています。LR-ExMは、ラベリング効率を高めて高い空間分解能を実現するための非常に効果的で柔軟な方法です。
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Protocol
1. 細胞培養
- マッコイ社製5A培地で培養したU2OS細胞を使用し、10%FBSを添加し、37°Cの5%CO2中。
- 取り扱いを容易にするために、16ウェル取り外し可能なチャンバーカバーガラス(培養面積0.4 cm2)上に細胞を培養します。
2.固定と透過処理
注:固定および透過処理の条件は、最適化された免疫染色プロトコルによって異なります。以下は、微小管およびクラスリンコーティングピット(CCP)の共免疫染色に対する固定および透過処理プロトコルです。
- 細胞数が~0.04 x 10 6に達したら、100 μLの3.2%パラホルムアルデヒド(PFA)をPEMバッファー(100 mM PIPES、1 mM EGTA、および1 mM MgCl2、pH6.9)で室温で10分間固定します(表1)。
注意: PFAを使用した固定は、認定された安全フードで行われます。 - 細胞を200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 100 μLの透過処理バッファーで細胞を室温で15分間透過処理します(表1)。
注:標的タンパク質、RNA、またはDNAの分解を回避し、最適な結果を得るために、できるだけ早く標識を進めてください。ただし、必要に応じて、固定サンプルを4°CのPBSバッファーに長期間(最大1か月)保存できます。 蒸発したPBSを交換し、サンプルを光退色から保護します。
3.内因性ストレプトアビジンおよびビオチンブロッキング
- 細胞ブロッキングバッファー(100 μL)で希釈したストレプトアビジン溶液で室温で15分間インキュベートします(表1)。
- 200 μLの細胞ブロッキングバッファーで短時間すすぎます。
- 細胞ブロッキングバッファーで希釈した100 μLのビオチン溶液で細胞を室温で15分間インキュベートします。
注: SNAP タグや CLIP- タグの使用など、自己ラベル付けタグ付けアプローチを使用する場合は、手順 4 をスキップして、手順 5.1: 自己ラベル付けタグ付けアプローチに進みます。
4. 一次抗体染色
- ラット抗αチューブリン抗体(1:500希釈)およびウサギ抗クラスリン重鎖抗体(1:100希釈)を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を4°Cで16時間、または室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのインキュベーション時間を2倍にします。
- サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。
5. LR-ExM特異的二次抗体染色
- IgG抗体と3官能性リンカー、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)-メタクリルアミド(MA)-ビオチンまたはNHS-MA-ジゴキシゲニン(Dig)とのコンジュゲート(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1で既に導入されている。自己標識タグ付けアプローチ:IgG抗体をMA-ベンジルグアニン(BG)-ビオチンまたはMA-ベンジルシトシン(BC)-Digなどの3官能性リンカーとコンジュゲートします(図1B)。三官能性アンカーの合成および二次抗体の結合は、Shiら1において既に導入されている。
- ロバ抗ウサギDig-MA(1:100希釈)およびロバ抗ラットビオチン-MA(1:100希釈)二次抗体を用いて、100 μLの細胞ブロッキングバッファー中で細胞を室温で1時間インキュベートします。組織サンプルのこのインキュベーション時間を2倍にします。
- サンプルを200 μLのPBSでそれぞれ5分間4回洗浄します。
6.追加のアンカー
- 細胞をPBS(100 μL)中の0.25%グルタルアルデヒド(GA)とともに室温で15分間インキュベートし、タンパク質をヒドロゲルに固定します。または、アンカーリングに25 mMメタクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MA-NHS)を使用します。室温で1時間のインキュベーションが推奨されます。
- サンプルをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
7.ゲル化
注:膨張速度は、塩と水のゲル内またはゲルへの拡散時間によって決まります。したがって、薄いゲルをキャストすると、膨張時間が短縮されます。
- 16ウェルゲルプレートの上部構造を取り外します。40 μLのモノマー溶液を各ウェルに加え、氷上で細胞をコンディショニングします。氷上で5分間インキュベートします。
- モノマー溶液を調製するには、 表2を参照してください。
- 氷上でゲル化溶液を調製する。二重蒸留水と10%N,N,N',N′テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)促進剤をモノマー溶液に加えます(10%TEMED:モノマー溶液= 1:47)。イニシエータをまだ追加しないでください(表3)。
- 面積0.4cm2の細胞培養チャンバーの場合、約40μLの容量のゲル化溶液を使用する。
- ゲル化溶液に10%過硫酸アンモニウム(APS)を加え、氷上でインキュベートし、直ちに40 μLのゲル化溶液を氷上の各シリコーンガスケットウェルにピペットで入れます。氷上で3分間インキュベートします(10%APS:10%TEMED:モノマー溶液= 1:1:47)。
- サンプルを光から保護し、10 cmのペトリ皿のカバーガラスを37°Cのインキュベーターに1.5時間移動してゲル化させます。37°Cのインキュベーション中にゲルの湿度を保つために、ペトリ皿を蓋で覆い、ペトリ皿に数滴の水を入れます。
8.消化
- ゲル化後、ガラスを取り外してゲルを分離し、ゲルを6ウェルプレートに移します。包埋細胞を2 mLの消化バッファー(表1)で室温または37°Cで4時間一晩消化します。 少なくとも10倍過剰量の消化バッファーを使用してください。
- 最終ゲル量よりも少なくとも10倍過剰量の水でゲルを洗浄します。毎回20〜30分間、洗浄手順を4回繰り返します。ゲルは各次元で約2倍に膨張します。
注:ゲルサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大1か月間保存できます。 乾燥を防ぐために蒸発した水を交換し、保管中にサンプルを光から保護します。三官能アンカーの劣化を避けるために、サンプルは消化と洗浄の後できるだけ早く染色する必要があります。
9. 消化後の蛍光染色
- 2 mL容量のストレプトアビジン(STV)/ジゴキシゲニン(DIG)染色バッファー中で、2〜5 μMのSTV色素および/または抗DIG色素を含むゲルを室温で24時間インキュベートします。サンプルは暗所に保管してください。
10. 拡張
- ゲルを過剰な水(2〜3 mL)で30分から1時間4回洗浄して膨張させます。
- 蛍光顕微鏡下で細胞を簡単に可視化するために、5回の洗浄のうち3回目にDAPIで細胞を染色します。DAPIストック濃度(5 mg/mL、4°Cで保存)を洗浄水で1:5,000希釈液で希釈します。ゲルをDAPI水溶液(2 mL)で30分から1時間インキュベートします。
- 3 mLの水でさらに2回洗浄します。
- サンプルを入れるのに十分な大きさの平らな皿にゲルを広げます。0.4cm2の面積カバーガラス上に調製された膨張ゲルは、ガラス底部6ウェルプレートにうまく収まる。
注:膨張後に染色されたサンプルは、4°CのPBSバッファーに最大4か月間保存できます。 乾燥を防ぎ、サンプルを光退色から保護するのに十分な水を追加します。イメージングの前に拡張およびDAPI染色ステップを繰り返します。蛍光色素の劣化のリスクを回避するには、サンプルをできるだけ早くイメージングする必要があります。
11. イメージング
- 6ウェルガラス底部イメージングチャンバーに0.01%ポリ-L-リジン(各3 mL)をコーティングし、ゲルサンプルを固定化します。
- ゲルサンプルをコーティングされたイメージングチャンバーに移します。
- 任意の蛍光スコープでサンプルを画像化します。
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Representative Results
クラスリン被覆ピット(CCP)は、三官能性アンカーを用いて免疫染色され(図1B)、LR-ExMは図1Aに記載されるように行われる。LR-ExM(図2C、E)は、タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM、図2A)またはビオチン-ExM(図2B)と比較して、はるかに高い蛍光強度を示します。LR-ExMの信号はproExMの約6倍でした(図2D)。LR-ExMは、回折限界よりもさらに小さいCCPなどの小さな構造を効果的に捕捉することができます(図2F、G)。
LR-ExMの代表的な結果のいくつかを免疫染色アプローチを使用して紹介します。微小管とCCPは、NHS-MA-DIGおよびNHS-MA-ビオチンを含む三機能性アンカーを使用して共免疫染色されます(図3A、B)。LR-ExMは、酵素タグベースのアプローチで利用可能です。結果は、図3C-Fの3つの機能アンカーBG-MA-ビオチン(スナップタグ用)およびBC-MA-DIG(CLIP-TAG用)を使用して実証されています。さらに、図3G-Jに示すように、LR-ExMでは免疫染色とタンパク質タグアプローチの両方を組み合わせることができます。これらの結果から、LR-ExMはラベリング効率と解像度を高めた高品質の画像を得るのに有益であることが確認されました。
LR-ExMは、組織サンプルでも優れた性能を示します。LR-ExMは、シナプス前マーカーのファゴットとシナプス後マーカーのホーマー1を共免疫染色することにより、マウスの脳組織に対して行われます。2つのラベルは透明で十分に分離されているため、高解像度とラベリング効率をサポートします(図4A-E)。
図1:ラベル保持拡大顕微鏡(LR-ExM)のワークフロー。 (a) LR-ExMのワークフロー(B)三機能アンカーの概略図。この図はShiら1から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クラスリン重鎖(POI)について間接的に免疫染色されたU2OS細胞におけるクラスリンコーティングピット(CCP)のシグナル保持(A-C)拡大顕微鏡(ExM)共焦点画像の定量化。(a)AF488結合二次抗体を用いたタンパク質保持性ExM(ProExM)。(B)ビオチン結合抗体を用いた増殖後標識によるExM。(C)NHS-MA-ビオチン三官能性アンカーと結合した抗体を用いたLR-ExM。BおよびCのサンプルは、ストレプトアビジン-AF488で拡張後染色されています。(D)A-Cの強度定量。エラーバーはSDを表します。 n = 3 各ケース。A、B、C、およびE-Gの画像の長さ拡大比は、それぞれ4.3、4.5、4.6、および4.3です。プロットDで使用したサンプルの長さ拡張比は、4.5±0.2です。スケールバー、500 nm(A-CおよびE)、および100 nm(FおよびG)。すべての縮尺記号は、拡張前のユニットにあります。arb.u.、任意の単位;STV、ストレプトアビジン。すべての画像は、60倍の水浸対物レンズ(NA1.27)を備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡(ニコンCSU-W1)を使用して取得されています。この図はShiら1から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:共焦点顕微鏡を用いたLR-ExMの代表的な結果。 (A,B)U2OS細胞におけるNHS-MA-ビオチン結合二次抗体(マゼンタ)で標識された微小管およびNHS-MA-DIG結合二次抗体(緑色)で標識されたCCPのLR-ExM共焦点画像。(B)拡大図。(C-F)タンパク質タグアプローチを使用して標識されたHeLa細胞におけるCCPおよび/またはミトコンドリアのLR-ExM共焦点画像(C)SNAPタグ標識クラスリン、(D)CLIPタグ標識TOMM20、および(E)2色イメージング。(F)拡大図。(G)免疫染色アプローチ(NPC、赤熱)とタンパク質タグアプローチ(SNAPタグ付きラミンA / C(シアン))の組み合わせを使用した2色共焦点LR-ExM画像。(H)拡大図。(I,J)Hの個々のチャンネルのビュー。なおGにおける細胞質バックグラウンドは抗NUP153抗体に起因する。A-B:4.7、C-D:4.4、E-F:4.5、G-Jの画像の長さ拡大比は4.5です。 スケールバー、Aは1 μm、BとFは200 nm、C-Eは500 nm、Gは2 μm、H、I、Jは500 nmです。すべての縮尺記号は、拡張前のユニットにあります。すべての画像は、60倍の水浸対物レンズ(NA1.27)を備えた回転円盤共焦点顕微鏡(Nikon CSU-W1)を使用して取得されています。この図はShiら1から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:組織サンプルに対するLR-ExMの代表的な結果。 (A)シナプス前マーカーのファゴット(マゼンタ)とシナプス後マーカーのホーマー1(緑)について間接的に免疫染色したマウス脳スライスのLR-ExM共焦点画像。(B,C)シナプスの拡大画像。(D,E)黄色のボックス長軸に沿った横方向の強度プロファイル。ファゴットはNHS-MA-DIG結合二次抗体で標識され、ホーマー1はNHS-MA-ビオチン結合二次抗体で標識されています。すべてのサンプルは、ストレプタビンジン-AF488および/または抗ジゴキシン-AF594で拡張後染色されます。 A-C の画像の長さ拡大比は4.2です。スケールバー、1 μm(A)、および200 nm(B、C)。すべての縮尺記号は、拡張前のユニットにあります。すべての画像は、60倍の水浸対物レンズ(NA1.27)を備えた回転円盤共焦点顕微鏡(Nikon CSU-W1)を使用して取得されています。この図はShiら1から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:化学薬品とバッファー この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:モノマー溶液 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:ゲル化溶液 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
LR-ExMの主な革新は、三官能アンカーを使用して標的タンパク質を効果的に標識し、画質を向上させることです。この方法は、研究者がそれほど容易に利用できない三機能アンカーによって制限されています。ただし、三機能アンカーはリクエストに応じて他の研究者と共有することができ、ChrometaのExMプローブなどの同様の製品も現在市販されています。
このプロトコルでは、一次抗体および二次抗体染色ステップのために室温で1時間のインキュベーションが行われています。ただし、これらのステップは代わりに4°Cで一晩行うことができ、一晩染色するとバックグラウンドノイズが低下することが観察されます。
ヒドロゲルの異方性膨張に由来する構造歪みを防止するためには、プロテアーゼ3を用いて徹底したタンパク質消化を行うことが重要である。しかし、以前の膨張顕微鏡では、蛍光標識の50%以上が重合およびタンパク質消化ステップ後に失われる可能性があり、その結果、画質が低下することが示されています3,4。この問題を解決するために、消化後に蛍光標識を導入することでシグナル損失を最小限に抑えるLR-ExMが開発されました1。
LR-ExMは、標的構造を研究するために免疫染色ベースの方法で広く使用できます。さらに、LR-ExMは、SNAPまたはCLIPタグベースのアプローチなどの自己標識タンパク質タグアプローチと組み合わせることができます。これは、目的の良好な抗体が利用できない場合や、標的特異性を改善する必要がある場合に特に役立ちます。
本稿では,長さ拡張係数が4前後のLR-ExMのプロトコルを紹介する.ただし、LR-ExMは、特定の膨張比またはサンプルの種類に限定されない。実際、この方法は、X10膨張顕微鏡4,11やTREx12などの既存の膨張顕微鏡と組み合わせて、より高い分解能を達成することができます。LR-ExMはpan-ExMと組み合わせることもできるため、特異性を犠牲にすることなく、タンパク質全体のランドスケープを高解像度で効果的に視覚化できます13。
以上をまとめると、LR-ExMは、細胞構造を高分解能かつ標識効率で解明するためのツールとして、多くの研究者に広く利用される可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(R00 GM126136からX.S.)、米国国立科学財団(DMS1763272からS.P.)、およびサイモンズ財団(594598からS.P.)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
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