Etikettbevaringsutvidelsesmikroskopi (LR-ExM) muliggjør superoppløsningsbilder og høyeffektiv merking
Summary
En protokoll for etikettretensjonsutvidelsesmikroskopi (LR-ExM) er demonstrert. LR-ExM bruker et nytt sett med trifunksjonelle ankre, som gir bedre merkingseffektivitet sammenlignet med tidligere introduserte ekspansjonsmikroskopier.
Abstract
Ekspansjonsmikroskopi (ExM) er en prøveprepareringsteknikk som kan kombineres med de fleste lysmikroskopimetoder for å øke oppløsningen. Etter innebygging av celler eller vev i svulmende hydrogel, kan prøver fysisk utvides tre til seksten ganger (lineær dimensjon) sammenlignet med den opprinnelige størrelsen. Derfor økes den effektive oppløsningen til et hvilket som helst mikroskop med ekspansjonsfaktoren. En stor begrensning av den tidligere introduserte ExM er redusert fluorescens etter polymerisering og fordøyelsesprosedyren. For å overvinne denne begrensningen er det utviklet etikettretensjonsutvidelsesmikroskopi (LR-ExM), som forhindrer signaltap og forbedrer merkingseffektiviteten kraftig ved hjelp av et sett med nye trifunksjonelle ankre. Denne teknikken gjør det mulig å oppnå høyere oppløsning når man undersøker cellulære eller subcellulære strukturer i nanometrisk skala med minimalt fluorescerende signaltap. LR-ExM kan brukes ikke bare til immunfluorescensmerking, men også med selvmerkende proteinkoder, for eksempel SNAP- og CLIP-tagger, og oppnår dermed høyere merkingseffektivitet. Dette arbeidet presenterer prosedyren og feilsøkingen for denne immunostaining-baserte tilnærmingen, samt diskusjon av selvmerkingsmerkingsmetoder for LR-ExM som et alternativ.
Introduction
Ekspansjonsmikroskopi (ExM) har blitt brukt av forskere siden det først ble introdusert som en praktisk tilnærming for å oppnå superoppløsningsavbildning med konvensjonelle mikroskoper, for eksempel epifluorescens og konfokale mikroskoper 1,2,3,4,5,6,7 . Ved hjelp av ExM er det mulig å oppnå ~ 70 nm lateral oppløsning selv med vanlige konfokale mikroskoper. Når ExM kombineres med bildebehandling med superoppløsning, forbedres oppløsningen ytterligere. For eksempel kan man oppnå omtrent 30 nm oppløsning med strukturert belysningsmikroskopi (SIM), og omtrent 4 nm oppløsning med stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM)1,5.
Imidlertid er lav merkingseffektivitet et kritisk problem med standard ExM-metoder. Fluorescenstap kan variere basert på type fluorescerende grupper og fordøyelsestid. I gjennomsnitt har det imidlertid blitt rapportert at mer enn 50% av fluoroforene går tapt etter polymerisasjonen og proteinfordøyelsestrinnene til ExM, noe som er skadelig for bildekvaliteten 3,4.
Dermed er det utviklet utvidelsesmikroskopi for etikettoppbevaring (LR-ExM), som effektivt kan beholde etiketter og redusere signaltap1. Den viktigste innovasjonen av LR-ExM er bruken av et sett med trifunksjonelle ankre i stedet for bare å bruke fluorescerende fargestoffer – som i standard ExM-prosedyre – for farging av proteiner av interesse. Disse trifunksjonelle linkerne består av tre deler: (1) kontakten (f.eks. N-hydroksysuccinimid (NHS)) for å koble til antistoffet, (2) ankeret (f.eks. Metakrylamid (MA)) for å forankre proteiner til polymeren, og (3) reporteren (f.eks. Biotin eller digoxigenin (DIG)) for å bøye seg til et organisk fargestoff. De trifunksjonelle ankrene overlever polymerisasjons- og proteinfordøyelsestrinnene, og forhindrer derfor fluorofortap.
Videre har denne metoden stort potensial siden den er kompatibel med selvmerkende enzymatiske koder som SNAP eller CLIP. Enzymatiske tag-tilnærminger har noen fordeler i forhold til immunostaining-tilnærmingen angående høy spesifisitet og merkingseffektivitet 8,9,10.
I dette manuskriptet er det vist en detaljert prosedyre for LR-ExM. LR-ExM er en svært effektiv og fleksibel metode for å oppnå høy romlig oppløsning med forbedret merkingseffektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigste innovasjonen til LR-ExM er å bruke trifunksjonelle ankre for effektivt å merke målproteinene og forbedre bildekvaliteten. Denne metoden er begrenset av trifunksjonelle ankre, som ikke er så lett tilgjengelige for forskere. Imidlertid kan trifunksjonelle ankre deles med andre forskere på forespørsel, og lignende produkter som ExM-sonder fra Chrometa er nå også kommersielt tilgjengelige.
I denne protokollen er det utført 1 time inkubasjon ved romtemperatur for de primære …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 til X.S.), U.S. National Science Foundation (DMS1763272 til S.P.) og Simons Foundation (594598 til S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
