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Biology

लेबल-अवधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और उच्च दक्षता लेबलिंग सक्षम करता है

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/63793
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

Summary

लेबल प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) का एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित किया गया है। एलआर-एक्सएम त्रिक्रियाशील एंकरों के एक नए सेट का उपयोग करता है, जो पहले पेश किए गए विस्तार माइक्रोस्कोपी की तुलना में बेहतर लेबलिंग दक्षता प्रदान करता है।

Abstract

विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) एक नमूना तैयार करने की तकनीक है जिसे रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए अधिकांश प्रकाश माइक्रोस्कोपी विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है। सूजन हाइड्रोगेल में कोशिकाओं या ऊतकों को एम्बेड करने के बाद, नमूनों को मूल आकार की तुलना में शारीरिक रूप से तीन से सोलह गुना (रैखिक आयाम) विस्तारित किया जा सकता है। इसलिए, किसी भी माइक्रोस्कोप का प्रभावी समाधान विस्तार कारक द्वारा बढ़ाया जाता है। पहले पेश किए गए एक्सएम की एक बड़ी सीमा पोलीमराइजेशन और पाचन प्रक्रिया के बाद प्रतिदीप्ति कम हो जाती है। इस सीमा को दूर करने के लिए, लेबल-अवधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) विकसित किया गया है, जो सिग्नल हानि को रोकता है और उपन्यास त्रिक्रियाशील एंकरों के एक सेट का उपयोग करके लेबलिंग दक्षता को बढ़ाता है। यह तकनीक न्यूनतम फ्लोरोसेंट सिग्नल हानि के साथ नैनोमेट्रिक पैमाने पर सेलुलर या उपकोशिकीय संरचनाओं की जांच करते समय उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की अनुमति देती है। एलआर-एक्सएम का उपयोग न केवल इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए किया जा सकता है, बल्कि स्व-लेबलिंग प्रोटीन टैग, जैसे एसएनएपी- और क्लिप-टैग के साथ भी किया जा सकता है, इस प्रकार उच्च लेबलिंग दक्षता प्राप्त होती है। यह काम इस इम्यूनोस्टेनिंग-आधारित दृष्टिकोण के लिए प्रक्रिया और समस्या निवारण प्रस्तुत करता है, साथ ही विकल्प के रूप में एलआर-एक्सएम के स्व-लेबलिंग टैगिंग दृष्टिकोण की चर्चा भी करता है।

Introduction

विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा किया गया है क्योंकि इसे पहली बार पारंपरिक माइक्रोस्कोप के साथ सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण के रूप में पेश किया गया था, जैसे कि एपिफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप 1,2,3,4,5,6,7 . एक्सएम का उपयोग करके, नियमित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ भी ~ 70 एनएम पार्श्व संकल्प प्राप्त करना संभव है। जब एक्सएम को सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ जोड़ा जाता है, तो रिज़ॉल्यूशन में और सुधार होता है। उदाहरण के लिए, कोई संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के साथ लगभग 30 एनएम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकता है, और स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म) 1,5 के साथ लगभग 4 एनएम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकता है।

हालांकि, कम लेबलिंग दक्षता मानक एक्सएम विधियों के साथ एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। फ्लोरोसेंट समूहों के प्रकार और पाचन समय के आधार पर प्रतिदीप्ति हानि भिन्न हो सकती है। औसतन, हालांकि, यह बताया गया है कि एक्सएम के पोलीमराइजेशन और प्रोटीन पाचन चरणों के बाद 50% से अधिक फ्लोरोफोर खो जाते हैं, जो इमेजिंग गुणवत्ता 3,4 के लिए हानिकारक है।

इस प्रकार, लेबल-अवधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) विकसित किया गया है, जो कुशलतापूर्वक लेबल को बनाए रख सकता है और सिग्नल हानि को कम करसकता है। एलआर-एक्सएम का मुख्य नवाचार केवल फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करने के बजाय त्रिक्रियाशील एंकरों के एक सेट का उपयोग करना है - जैसा कि मानक एक्सएम प्रक्रिया में - रुचि के प्रोटीन को धुंधला करने के लिए। इन त्रिक्रियाशील लिंकरों में तीन भाग होते हैं: (1) एंटीबॉडी से जुड़ने के लिए कनेक्टर (जैसे, एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड (एनएचएस)), (2) पॉलिमर में प्रोटीन को लंगर डालने के लिए एंकर (जैसे, मेथैक्रिलामाइड (एमए)), और (3) रिपोर्टर (जैसे, बायोटिन या डिगॉक्सिगेनिन (डीआईजी)) एक कार्बनिक डाई से संयुग्मित करने के लिए। ट्राइफंक्शनल एंकर पोलीमराइजेशन और प्रोटीन पाचन चरणों से बचते हैं, और इसलिए फ्लोरोफोरे के नुकसान को रोकते हैं।

इसके अलावा, यह विधि बहुत क्षमता रखती है क्योंकि यह एसएनएपी या क्लिप जैसे स्व-लेबलिंग एंजाइमेटिक टैग के साथ संगत है। एंजाइमैटिक टैग दृष्टिकोण में उच्च विशिष्टता और लेबलिंग दक्षता 8,9,10 के बारे में इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण पर कुछ लाभ हैं।

इस पांडुलिपि में, एलआर-एक्सएम की एक विस्तृत प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया है। एलआर-एक्सएम बढ़ी हुई लेबलिंग दक्षता के साथ उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रभावी और लचीली विधि है।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. मैककॉय के 5 ए माध्यम में संवर्धित यू 2 ओएस कोशिकाओं का उपयोग 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस के साथ पूरक करें।
  2. हैंडलिंग में आसानी के लिए 16 अच्छी तरह से हटाने योग्य कक्षित कवरग्लास (संस्कृति क्षेत्र 0.4 सेमी 2) परसंस्कृति कोशिकाएं।

2. निर्धारण और पारगम्यता

नोट: निर्धारण और परमेबिलाइजेशन की स्थिति अनुकूलित इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल पर निर्भर करती है। निम्नलिखित सह-इम्यूनोस्टेन सूक्ष्मनलिकाएं और क्लैथ्रिन लेपित गड्ढे (सीसीपी) के लिए एक निर्धारण और परमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल है।

  1. एक बार जब सेल की गिनती ~ 0.04 x 106 तक पहुंच जाती है, तो कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीईएम बफर (100 एमएम पाइप, 1 एमएम ईजीटीए, और 1 एमएम एमजीसीएल 2, पीएच 6.9) में3.2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 100 μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (तालिका 1)।
    नोट: पीएफए का उपयोग करके निर्धारण एक प्रमाणित सुरक्षा हुड में किया जाता है।
  2. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 200 μL के साथ कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर परमेबिलाइजेशन बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को प्रतिबिलाइज करें (तालिका 1)।
    नोट: लक्ष्य प्रोटीन, आरएनए या डीएनए क्षरण से बचने और इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए जितनी जल्दी हो सके लेबलिंग के साथ आगे बढ़ें। यदि इसकी आवश्यकता है, हालांकि, निश्चित नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस बफर में लम्बी समय (एक महीने तक) के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं। किसी भी वाष्पित पीबीएस को बदलें और नमूने को फोटोब्लीचिंग से बचाएं।

3. अंतर्जात स्ट्रेप्टाविडिन और बायोटिन ब्लॉकिंग

  1. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेल ब्लॉकिंग बफर (100 μL) में पतला स्ट्रेप्टाविडिन समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (तालिका 1)।
  2. सेल ब्लॉकिंग बफर के 200 μL के साथ संक्षेप में कुल्ला करें।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेल ब्लॉकिंग बफर में पतला 100 μL बायोटिन समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: स्व-लेबलिंग टैगिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, जैसे कि SNAP- या CLIP-टैग का उपयोग करते समय, चरण 4 को छोड़ दें, और चरण 5.1 पर आगे बढ़ें: स्व लेबलिंग टैगिंग दृष्टिकोण।

4. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला होना

  1. चूहे के एंटी-α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (1: 500 कमजोर पड़ने) और खरगोश एंटी-क्लैथ्रिन हेवी-चेन एंटीबॉडी (1: 100 कमजोर पड़ने) के साथ कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेल ब्लॉकिंग बफर के 100 μL में इनक्यूबेट करें। ऊतक के नमूनों के लिए इनक्यूबेशन समय को दोगुना करें।
  2. नमूने को 5 मिनट के लिए पीबीएस के 200 μL के साथ चार बार धोएं।

5. एलआर-एक्सएम विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला

  1. एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड (एनएचएस) - मेथाक्रिलामाइड (एमए) -बायोटिन या एनएचएस-एमए-डिगॉक्सिगेनिन (डिग) जैसे ट्राइफंक्शनल लिंकर के साथ संयुग्म आईजीजी एंटीबॉडी (चित्रा 1 बी)। त्रिक्रियाशील लंगरों का संश्लेषण और द्वितीयक एंटीबॉडी का संयुग्मन पहले शी एट अल.1 में पेश किया गया था। स्व-लेबलिंग टैगिंग दृष्टिकोण: त्रिकोणीय लिंकर के साथ संयुग्म आईजीजी एंटीबॉडी, जैसे एमए-बेंजाइलग्वानिन (बीजी)-बायोटिन या एमए-बेंजाइलसाइटोसिन (बीसी)-डिग (चित्रा 1 बी)। त्रिक्रियाशील लंगरों का संश्लेषण और द्वितीयक एंटीबॉडी का संयुग्मन पहले शी एट अल.1 में पेश किया गया था।
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेल ब्लॉकिंग बफर के 100 μL में गधे विरोधी खरगोश-डिग-एमए (1: 100 कमजोर पड़ने) और गधे विरोधी चूहे-बायोटिन-एमए (1: 100 कमजोर पड़ने) द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। ऊतक के नमूनों के लिए इस इनक्यूबेशन समय को दोगुना करें।
  3. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के 200 μL में नमूने चार बार धोएं।

6. अतिरिक्त एंकरिंग

  1. हाइड्रोजेल पर प्रोटीन को लंगर डालने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस (100 μL) में 0.25% ग्लूटारल्डिहाइड (जीए) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, एंकरिंग के लिए 25 एमएम मेथैक्रिलिक एसिड एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड एस्टर (एमए-एनएचएस) का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर एक घंटे इनक्यूबेशन को प्रोत्साहित किया जाता है।
  2. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार नमूने धोएं।

7. गेलेशन

नोट: विस्तार की गति नमक और पानी के बाहर या जेल में प्रसार समय से निर्धारित होती है; इस प्रकार, पतले जैल डालने से विस्तार का समय तेज हो जाता है।

  1. 16-वेल जेल प्लेट की ऊपरी संरचना को हटा दें। बर्फ पर कोशिकाओं को कंडीशन करने के लिए प्रत्येक कुएं में 40 μL मोनोमर समाधान जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    1. मोनोमर समाधान तैयार करने के लिए, तालिका 2 देखें।
  2. बर्फ पर गेलेशन समाधान तैयार करें। मोनोमर समाधान में डबल आसुत जल और 10% एन, एन, एन', एन' टेट्रामेथिलिथिलीनडायमाइन (टीईएमईडी) त्वरक जोड़ें (10% टीईएमईडी: मोनोमर समाधान = 1: 47); आरंभकर्ता को अभी तक न जोड़ें (तालिका 3)।
  3. 0.4 सेमी2 के क्षेत्र वाले सेल कल्चर कक्ष के लिए, लगभग 40 μL के गेलेशन समाधान मात्रा का उपयोग करें। प्रत्येक कुएं के लिए 45 μL गेलेशन समाधान तैयार करें।
  4. गेलेशन समाधान में 10% अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) जोड़ें, बर्फ पर इनक्यूबेट करें, और तुरंत बर्फ पर प्रत्येक सिलिकॉन गैसकेट में 40 μL जेलेशन समाधान का पाइप करें। 3 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें (10% एपीएस: 10% टीईएमईडी: मोनोमर समाधान = 1: 1: 47)।
  5. नमूने को प्रकाश से बचाएं और 10 सेमी पेट्री डिश में कवरग्लास को गेलेशन के लिए 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाएं। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन के दौरान जेल की आर्द्रता को बनाए रखने के लिए, पेट्री डिश को ढक्कन के साथ कवर करें, और पेट्री डिश में पानी की कुछ बूंदें डालें।

8. पाचन

  1. गेलेशन के बाद, जेल को अलग करने के लिए गिलास को हटा दें और जेल को 6 वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर रात भर या 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के पाचन बफर (तालिका 1) के साथ एम्बेडेड कोशिकाओं को पचाएं। पाचन बफर की कम से कम 10 गुना अतिरिक्त मात्रा का उपयोग करें।
  2. अंतिम जेल की मात्रा की तुलना में कम से कम 10 गुना अधिक मात्रा में पानी के साथ जैल धोएं। हर बार 20 से 30 मिनट के लिए धोने के चरण को चार बार दोहराएं। जेल प्रत्येक आयाम में लगभग दो गुना तक फैलता है।
    नोट: जेल के नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस बफर में 1 महीने तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। सूखने से बचने के लिए किसी भी वाष्पित पानी को बदलें, और भंडारण के दौरान नमूने को प्रकाश से बचाएं। ट्राइफंक्शनल एंकर के क्षरण से बचने के लिए, नमूनों को पाचन और धोने के बाद जल्द से जल्द दाग दिया जाना चाहिए।

9. पाचन के बाद प्रतिदीप्ति धुंधला होना

  1. कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 2 से 5 μM STV-डाई और/या एंटी-डीआईजी-डाई के साथ 2 mL मात्रा में स्ट्रेप्टाविडिन (STV)/digoxigenin (DIG) धुंधला बफर में जैल को इनक्यूबेट करें। नमूने को अंधेरे में रखें।

10. विस्तार

  1. हर बार 30 मिनट से 1 घंटे के लिए अत्यधिक पानी (2-3 एमएल) के साथ जेल को चार बार धोएं और विस्तारित करें।
  2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत कोशिकाओं के आसान विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, पांच वॉश में से तीसरे के दौरान DAPI के साथ दाग कोशिकाएं। धोने के पानी में 1: 5,000 कमजोर पड़ने में डीएपीआई स्टॉक एकाग्रता (5 मिलीग्राम / एमएल, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) को पतला करें। जेल को 30 मिनट से 1 घंटे के लिए DAPI-पानी के घोल (2 mL) के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. 3 मिलीलीटर पानी से दो अतिरिक्त बार धोएं।
  4. किसी भी फ्लैट डिश में जैल का विस्तार करें जो नमूने को शामिल करने के लिए काफी बड़ा है। विस्तारित जैल जो 0.4 सेमी2 क्षेत्र कवरग्लास पर तैयार किए जाते हैं, ग्लास बॉटम 6-वेल प्लेट में अच्छी तरह से फिट होते हैं।
    नोट: विस्तार के बाद के दाग वाले नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस बफर में 4 महीने तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। सुखाने से बचने और नमूने को फोटोब्लीचिंग से बचाने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें। इमेजिंग से पहले विस्तार और DAPI धुंधला चरण दोहराएं। फ्लोरोफोरे क्षरण के किसी भी जोखिम से बचने के लिए, नमूनों को जल्द से जल्द चित्रित करने की आवश्यकता है।

11. इमेजिंग

  1. जेल के नमूनों को स्थिर करने के लिए 0.01% पॉली-एल-लाइसिन (प्रत्येक 3 एमएल) के साथ 6-वेल ग्लास बॉटम इमेजिंग कक्ष को कोट करें।
  2. लेपित इमेजिंग कक्ष में जेल के नमूने स्थानांतरित करें।
  3. किसी भी वांछित प्रतिदीप्ति स्कोप के साथ नमूने की छवि।

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Representative Results

क्लैथ्रिन-लेपित गड्ढे (सीसीपी) ट्राइफंक्शनल एंकर (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड होते हैं और एलआर-एक्सएम को चित्रा 1 ए में वर्णित के रूप में किया जाता है। एलआर-एक्सएम (चित्रा 2 सी, ई) प्रोटीन-प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (प्रोएक्सएम, चित्रा 2 ए) या बायोटिन-एक्सएम (चित्रा 2 बी) की तुलना में बहुत अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाता है; एलआर-एक्सएम के लिए सिग्नल प्रोएक्सएम (चित्रा 2 डी) की तुलना में लगभग छह गुना अधिक था। एलआर-एक्सएम प्रभावी रूप से सीसीपी जैसी छोटी संरचनाओं को पकड़ सकता है, जो विवर्तन सीमा (चित्रा 2 एफ, जी) से भी छोटे हैं।

एलआर-एक्सएम के कुछ प्रतिनिधि परिणाम इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रदर्शित किए जाते हैं। माइक्रोट्यूबुल्स और सीसीपी ट्राईफंक्शनल एंकर का उपयोग करके सह-इम्यूनोस्टेन्ड होते हैं, जिनमें एनएचएस-एमए-डीआईजी और एनएचएस-एमए-बायोटिन (चित्रा 3 ए, बी) शामिल हैं। एलआर-एक्सएम एंजाइमेटिक टैग-आधारित दृष्टिकोण के लिए उपलब्ध है। परिणाम चित्रा 3 सी-एफ में ट्राईफंक्शनल एंकर बीजी-एमए-बायोटिन (एसएनएपी-टैग के लिए) और बीसी-एमए-डीआईजी (सीएलआईपी-टैग के लिए) का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, कोई एलआर-एक्सएम में इम्यूनोस्टेनिंग और प्रोटीन-टैग दृष्टिकोण दोनों को जोड़ सकता है जैसा कि चित्रा 3 जी-जे में दिखाया गया है। इन परिणामों से, यह पुष्टि की जाती है कि एलआर-एक्सएम बढ़ी हुई लेबलिंग दक्षता और संकल्प के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए फायदेमंद है।

एलआर-एक्सएम ऊतक के नमूनों में भी महान प्रदर्शन दिखाता है। एलआर-एक्सएम माउस मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रीसिनेप्टिक मार्कर बासून और पोस्टसिनेप्टिक मार्कर होमर 1 को सह-इम्यूनोस्टेनिंग करके किया जाता है। दो लेबल स्पष्ट और अच्छी तरह से अलग हैं, जो उच्च रिज़ॉल्यूशन और लेबलिंग दक्षता (चित्रा 4 ए-ई) का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: लेबल अवधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) का वर्कफ़्लो। (ए) एलआर-एक्सएम का वर्कफ़्लो। (बी) त्रिक्रियाशील एंकरों की योजनाबद्धता। इस आंकड़े को शी एट अल.1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: यू 2 ओएस कोशिकाओं में क्लैथ्रिन-लेपित गड्ढों (सीसीपी) के सिग्नल प्रतिधारण (ए-सी) विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) कॉन्फोकल छवियों का परिमाणीकरण अप्रत्यक्ष रूप से क्लैथ्रिन हेवी-चेन (पीओआई) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड है। (ए) एएफ 488-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन-प्रतिधारण एक्सएम (प्रोएक्सएम)। (बी) बायोटिन-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके पोस्ट-विस्तार लेबलिंग के साथ एक्सएम। (सी) एनएचएस-एमए-बायोटिन ट्राइफंक्शनल एंकर के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके एलआर-एक्सएम। बी और सी में नमूने स्ट्रेप्टाविडिन-एएफ 488 के साथ विस्तार के बाद के दाग हैं। (घ) ए-सी की तीव्रता का परिमाणन। त्रुटि पट्टियाँ प्रत्येक मामले के लिए SD. n = 3 का प्रतिनिधित्व करती हैं. ए, बी, सी और ई-जी में छवियों के लिए लंबाई विस्तार अनुपात क्रमशः 4.3, 4.5, 4.6 और 4.3 हैं। प्लॉट डी में उपयोग किए गए नमूनों के लिए लंबाई विस्तार अनुपात 4.5 ± 0.2 है। स्केल बार, 500 एनएम (ए-सी और ई), और 100 एनएम (एफ और जी)। सभी स्केल बार पूर्व-विस्तार इकाइयों में हैं। arb. यू., मनमानी इकाइयाँ; एसटीवी, स्ट्रेप्टाविडिन। सभी छवियों को 60x जल विसर्जन उद्देश्य (NA1.27) के साथ एक स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (Nikon CSU-W1) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इस आंकड़े को शी एट अल.1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए, बी) एनएचएस-एमए-बायोटिन-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (मैजेंटा) और सीसीपी के साथ लेबल किए गए सूक्ष्मनलिकाएं की एलआर-एक्सएम कॉन्फोकल छवियां जो एनएचएस-एमए-डीआईजी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (हरे) के साथ लेबल की गई हैं। (बी) आवर्धित दृश्य। (C-F) हेला कोशिकाओं में सीसीपी और / या माइटोकॉन्ड्रिया की एलआर-एक्सएम कॉन्फोकल छवियां प्रोटीन टैग दृष्टिकोण (सी) एसएनएपी टैग-लेबल क्लैथ्रिन, (डी) क्लिप टैग-लेबल टीओएमएम 20, और (ई) दो-रंग इमेजिंग का उपयोग करके लेबल की गई हैं। (च) आवर्धित दृश्य। (जी) इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण (एनपीसी, लाल गर्म) और प्रोटीन-टैग दृष्टिकोण (एसएनएपी-टैग्ड लैमिन ए / सी (सियान)) के संयोजन का उपयोग करके दो-रंग कॉन्फोकल एलआर-एक्सएम छवियां। (ज) आवर्धित दृश्य। (I, J) H के अलग-अलग चैनलों के विचार। ध्यान दें कि जी में साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि एंटी-एनयूपी 153 एंटीबॉडी के कारण होती है। ए-बी: 4.7, सी-डी: 4.4, ई-एफ: 4.5 और जी-जे में छवियों के लिए लंबाई विस्तार अनुपात 4.5 है। स्केल बार, ए के लिए 1 μm, B और F के लिए 200 nm, C-E के लिए 500 nm, G के लिए 2 μm, और H, I और J के लिए 500 nm। सभी स्केल बार पूर्व-विस्तार इकाइयों में हैं। सभी छवियों को 60x जल विसर्जन उद्देश्य (NA1.27) के साथ एक स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (Nikon CSU-W1) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इस आंकड़े को शी एट अल.1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ऊतक नमूनों पर एलआर-एक्सएम के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) माउस मस्तिष्क स्लाइस की एलआर-एक्सएम कॉन्फोकल छवि अप्रत्यक्ष रूप से प्रीसिनेप्टिक मार्कर बासून (मैजेंटा) और पोस्टसिनेप्टिक मार्कर होमर 1 (हरा) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड है। (बी, सी) सिनैप्स की ज़ूम-इन छवियां। (D, E) पीले बॉक्स लंबे अक्षों के साथ अनुप्रस्थ तीव्रता प्रोफाइल। बासून को एनएचएस-एमए-डीआईजी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है, और होमर 1 को एनएचएस-एमए-बायोटिन-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है। सभी नमूने विस्तार के बाद स्ट्रेप्टाविंडिन-एएफ 488 और या एंटी-डिगॉक्सिन-एएफ 594 से दागदार हैं। ए-सी में छवियों के लिए लंबाई विस्तार अनुपात 4.2 है। स्केल बार, 1 μm (A), और 200 nm (B, C)। सभी स्केल बार पूर्व-विस्तार इकाइयों में हैं। सभी छवियों को 60x जल विसर्जन उद्देश्य (NA1.27) के साथ एक स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (Nikon CSU-W1) का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इस आंकड़े को शी एट अल.1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: रसायन और बफर कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: मोनोमर समाधान कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: गेलेशन समाधान कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एलआर-एक्सएम का प्रमुख नवाचार लक्ष्य प्रोटीन को प्रभावी ढंग से लेबल करने और छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए त्रिक्रियाशील एंकर का उपयोग करना है। यह विधि त्रिक्रियाशील एंकरों द्वारा सीमित है, जो शोधकर्ताओं के लिए इतनी आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, अनुरोध पर अन्य शोधकर्ताओं के साथ त्रिक्रियाशील एंकर साझा किए जा सकते हैं, और क्रोम्टा से एक्सएम जांच जैसे समान उत्पाद अब व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं।

इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला चरणों के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे की इनक्यूबेशन की गई है। हालांकि, इन चरणों को वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है, और यह देखा गया है कि रात भर धुंधला होने से पृष्ठभूमि का शोर कम हो जाता है।

हाइड्रोजेल के अनिसोट्रोपिक विस्तार से प्राप्त संरचनात्मक विकृति को रोकने के लिए, प्रोटीज3 का उपयोग करके पूरी तरह से प्रोटीन पाचन करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, पिछले विस्तार माइक्रोस्कोपी दिखाते हैं कि पोलीमराइजेशन और प्रोटीन पाचन चरणों के बाद 50% से अधिक फ्लोरेसेंस लेबल खो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप खराब छवि गुणवत्ता 3,4 होती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एलआर-एक्सएम विकसित किया गया है, जो पाचन1 के बाद फ्लोरोसेंट लेबल पेश करके सिग्नल के नुकसान को कम करता है।

लक्ष्य संरचना का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग-आधारित तरीकों के साथ एलआर-एक्सएम का व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, एलआर-एक्सएम को स्व-लेबलिंग प्रोटीन टैग दृष्टिकोण जैसे एसएनएपी- या क्लिप-टैग आधारित दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है। यह विशेष रूप से सहायक होता है जब रुचि के अच्छे एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं होते हैं या यदि किसी को बेहतर लक्ष्य विशिष्टता की आवश्यकता होती है।

इस पेपर में, लगभग 4 के लंबाई विस्तार कारक के साथ एलआर-एक्सएम का प्रोटोकॉल पेश किया गया है। हालांकि, एलआर-एक्सएम कुछ विस्तार अनुपात या नमूनों के प्रकार तक सीमित नहीं है। वास्तव में, इस विधि को उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए किसी भी पूर्व-मौजूदा विस्तार माइक्रोस्कोपी, जैसे एक्स 10 विस्तार माइक्रोस्कोपी 4,11 या टीआरईएक्स12 के साथ जोड़ा जा सकता है। एलआर-एक्सएम को पैन-एक्सएम के साथ भी जोड़ा जा सकता है, ताकि यह विशिष्टता13 का त्याग किए बिना उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे प्रोटीन परिदृश्य को प्रभावी ढंग से कल्पना कर सके।

सारांश में, एलआर-एक्सएम में उच्च रिज़ॉल्यूशन और लेबलिंग दक्षता के साथ सेलुलर संरचनाओं को स्पष्ट करने के लिए एक उपकरण के रूप में कई शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किए जाने की क्षमता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर 00 जीएम 126136 से एक्सएस), यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (डीएमएस 1763272 से एसपी) और सिमंस फाउंडेशन (594598 से एसपी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide  Sigma  A9099  ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch H+L, 711–005-152 Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch H+L, 712–005-153 Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-540-084 Fluorescent probes 
Alexa Fluor 594 Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-580-084 Fluorescent probes 
Alexa Fluor 647 Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-600-084 Fluorescent probes 
Ammonium Persulfate  Sigma  A3678  ExM Gel
anti-H3K4me3 Abcam ab8580 Antibody
anti-H3K9me3 Abcam ab176916 Antibody
DAPI dilacetate Thermofisher Scientific D3571 Fluorescent probes 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) Vector Laboratories DI-7488 Fluorescent probes 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) Vector Laboratories DI-7594 Fluorescent probes 
EGTA EMD Millipore Corp. 324626-25GM Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma  EDTA Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade Electron Microscopy Sciences 50-262-13 Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass Grace Bio-Labs  GBL112358-8EA Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool Grace Bio-Labs  GBL103259 Removal tool
Guanidine HCl  Sigma  G3272  Digestion buffer
Magnesium chloride Sigma M8266-1KG Fixation buffer
McCoy's 5a ATCC 30–2007 Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS) Sigma  730300-1G Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody Abcam ab24700 Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide  Sigma  M7279  ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma  T7024  ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions Electron Microscopy Sciences 50-980-487 Fixation buffer
PIPES Sigma P6757-25G Fixation buffer
Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML Chamber coating
Proteinase K  Sigma-Aldrich P4850-5ML Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody Abcam ab21679 Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 Millipore Sigma MAB1864-I Antibody
Sodium Acrylate  Sigma 408220 ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit Vector Laboratories SP-2002 Blocking buffer
Tris-HCl  Life Technologies  AM9855  Digestion buffer
U2OS ATCC HTB-96 Cell line
6 well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N Imaging plate

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References

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  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
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  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 188 विस्तार माइक्रोस्कोपी उच्च लेबलिंग दक्षता एसएनएपी-टैग सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी
लेबल-अवधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (एलआर-एक्सएम) सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और उच्च दक्षता लेबलिंग सक्षम करता है
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Park, S., Zhuang, Y., Shi, X.… More

Park, S., Zhuang, Y., Shi, X. Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling. J. Vis. Exp. (188), e63793, doi:10.3791/63793 (2022).

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