הדגמת עצבנות עור שעירה וגלברוסית בתבנית תלת-ממדית באמצעות גישות מרובות של כתמים פלואורסצנטיים וניקוי רקמות
Summary
עובי חלקי הרקמות הגביל את המחקר המורפולוגי של העצבנות של העור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי רקמות ייחודית להדמיית סיבי עצב עוריים בחתכי רקמה עבים של 300 מיקרומטר תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Abstract
עצבנות העור היא חלק חשוב ממערכת העצבים ההיקפית. למרות שהמחקר של סיבי העצב העוריים התקדם במהירות, רוב ההבנה של המאפיינים ההפצתיים והכימיים שלהם מגיעה מהכתמים היסטוכימיים ואימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים על חלקי רקמה דקים. עם התפתחות טכניקת ניקוי הרקמה, ניתן היה לראות את סיבי העצב העוריים על חלקי רקמה עבים יותר. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כתמים פלואורסצנטיים מרובים על מקטעי רקמות בעובי של 300 מיקרומטר מהעור הכפי והגבי של כף הרגל האחורית של החולדה, שני אתרי העור השעירים והזוהרים האופייניים. כאן, הפפטיד הקשור לגן קלציטונין מסמן את סיבי העצב החושיים, בעוד שפלואידין וקולטן אנדותל היאלורונן אנדותל כלי הלימפה 1 מסמנים את הדם וכלי הלימפה, בהתאמה. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, סיבי העצב החושיים המסומנים היו במעקב מלא במרחק ארוך יותר, רצים בצרורות בשכבה העורית העמוקה ובסגנון חופשי בשכבה השטחית. סיבי עצב אלה זרמו במקביל לכלי הדם או הקיפו אותם, וכלי הלימפה יצרו רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) בעור השעיר והזוהר. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה יותר לחקר העצבנות של העור מאשר השיטות הקונבנציונליות הקיימות מנקודת המבט המתודולוגית.
Introduction
העור, האיבר הגדול ביותר בגוף, המשמש כממשק מפתח לסביבה, מופנם בצפיפות על ידי סיבי עצב רבים 1,2,3. למרות שעיוורון העור נחקר באופן נרחב בעבר בשיטות היסטולוגיות שונות, כגון צביעה על מקטעי עור ורקמות שלמים 4,5,6, ההדגמה היעילה המפורטת של סיבי עצב עוריים היא עדיין אתגר 7,8. בהתחשב בכך, הפרוטוקול הנוכחי פיתח טכניקה ייחודית להצגת סיבי עצב עוריים בצורה ברורה יותר בחלק הרקמה העבה.
בגלל הגבול של עובי החלקים, התצפית על סיבי עצב עור פנימיים אינה מדויקת מספיק כדי לתאר במדויק את הקשר בין סיבי עצב פפטידים הקשורים לגן קלציטונין (CGRP) לבין רקמות ואיברים מקומיים ממידע התמונה שנרכש. הופעתה של טכנולוגיית ניקוי רקמות תלת-ממדית מספקת שיטה אפשרית לפתרון בעיה זו 9,10. ההתפתחות המהירה של גישות לניקוי רקמות הציעה כלים רבים לחקר מבני רקמות, איברים שלמים, הקרנות עצביות ובעלי חיים שלמים בתקופה האחרונה11. ניתן היה לדמות את רקמת העור השקופה בקטע עבה הרבה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל את הנתונים כדי לדמיין סיבי עצב עוריים.
במחקר הנוכחי, העור הכפי והגבי של כף רגל אחורית של חולדה נבחר כשני אתרי המטרה של עור שעיר וגלברוס 3,4,7. כדי להתחקות אחר סיבי העצב העוריים במרחק רב יותר, רקמת העור נחתכה בעובי של 300 מיקרומטר לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית והיסטוכימית, ולאחר מכן טיפול בפינוי רקמות. CGRP שימש לסימון סיבי העצב החושיים12,13. בנוסף, כדי להדגיש את סיבי העצב העוריים על רקע הרקמה, נעשה שימוש נוסף בפלואידין ובקולטן היאלורונן אנדותל לימפתי 1 (LYVE1) כדי לתייג את כלי הדם וכלי הלימפה, בהתאמה14,15.
גישות אלה סיפקו שיטה פשוטה שניתן ליישם כדי להדגים תצוגה ברזולוציה גבוהה של סיבי העצב העוריים וגם כדי לדמיין את המתאם המרחבי בין סיבי העצב, כלי הדם וכלי הלימפה בעור, אשר עשוי לספק הרבה יותר מידע כדי להבין את ההומאוסטזיס של העור הרגיל ואת השינוי העורי בתנאים הפתולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מספק הדגמה מפורטת של סיבי העצב העוריים בעור השעיר והזוהר על ידי שימוש באימונופלואורסצנציה על חלקי רקמות עבים יותר עם טיפול ניקוי ותצוגה תלת-ממדית כדי להבין טוב יותר את העצבנות של העור. זמן הדגירה של הנוגדנים של עד 1-2 ימים ותהליך ניקוי לילה חשובים. שני שלבים מרכזיים אלה משפיעים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה הסינית לחדשנות במדעי הרפואה של סין (קוד פרויקט מס’. CI2021A03404) והקרן הלאומית הלאומית לחדשנות בין-תחומית ברפואה סינית מסורתית (קוד פרויקט מס’ ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
