إظهار تعصيب الجلد المشعر و Glabrous في نمط 3D باستخدام أساليب تلطيخ الفلورسنت المتعددة وإزالة الأنسجة
Summary
حد سمك أقسام الأنسجة من الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة لإزالة الأنسجة لتصور الألياف العصبية الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي تبلغ سماكتها 300 ميكرومتر تحت المجهر البؤري.
Abstract
تعصيب الجلد هو جزء مهم من الجهاز العصبي المحيطي. على الرغم من أن دراسة الألياف العصبية الجلدية قد تقدمت بسرعة ، إلا أن معظم فهم خصائصها التوزيعية والكيميائية يأتي من تلطيخ الأنسجة الكيميائية التقليدية والكيميائية المناعية على أقسام الأنسجة الرقيقة. مع تطور تقنية إزالة الأنسجة ، أصبح من الممكن عرض الألياف العصبية الجلدية على أقسام الأنسجة الأكثر سمكا. يصف هذا البروتوكول تلطيخ الفلورسنت المتعدد على أقسام الأنسجة بسماكة 300 ميكرومتر من الجلد الأخمصي والظهري للقدم الخلفية للفئران ، وهما موقعان نموذجيان للبشرة المشعرة والزجاجية. هنا ، يقوم الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين بتسمية الألياف العصبية الحسية ، في حين أن الفيلويدين ومستقبل الهيالورونان البطاني البطاني للأوعية اللمفاوية 1 يصنفان الأوعية الدموية واللمفاوية ، على التوالي. تحت المجهر البؤري ، تم اتباع الألياف العصبية الحسية المسماة بالكامل على مسافة أطول ، وتعمل في حزم في الطبقة الجلدية العميقة وحرة في الطبقة السطحية. ركضت هذه الألياف العصبية بالتوازي مع الأوعية الدموية أو تحيط بها ، وشكلت الأوعية اللمفاوية شبكة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجلد المشعر والزجاجي. يوفر البروتوكول الحالي نهجا أكثر فعالية لدراسة تعصيب الجلد من الطرق التقليدية الحالية من منظور المنهجية.
Introduction
الجلد ، أكبر عضو في الجسم ، بمثابة واجهة رئيسية للبيئة ، يتم تعصيبه بكثافة من قبل العديد من الألياف العصبية1،2،3. على الرغم من أن تعصيب الجلد قد تمت دراسته على نطاق واسع سابقا باستخدام طرق نسيجية مختلفة ، مثل التلطيخ على أقسام الجلد والأنسجة الكاملة4،5،6 ، إلا أن العرض الفعال المفصل للألياف العصبية الجلدية لا يزال يمثل تحديا7،8. وبالنظر إلى ذلك، طور البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لإظهار الألياف العصبية الجلدية بشكل أكثر وضوحا في قسم الأنسجة السميكة.
بسبب الحد الأقصى لسمك الأقسام ، فإن مراقبة الألياف العصبية الجلدية المعصوبة ليست دقيقة بما يكفي لتصوير العلاقة بين الألياف العصبية للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والأنسجة والأعضاء المحلية بدقة من معلومات الصورة المكتسبة. يوفر ظهور تقنية إزالة الأنسجة ثلاثية الأبعاد طريقة مجدية لحل هذه المشكلة 9,10. قدم التطور السريع لنهج تطهير الأنسجة العديد من الأدوات لدراسة هياكل الأنسجة والأعضاء بأكملها والإسقاطات العصبية والحيوانات الكاملة في الآونة الأخيرة11. يمكن تصوير أنسجة الجلد الشفافة في قسم أكثر سمكا بواسطة المجهر البؤري للحصول على البيانات اللازمة لتصور الألياف العصبية الجلدية.
في الدراسة الحالية ، تم اختيار الجلد الأخمصي والظهري للفئران الخلفية كموقعين مستهدفين للجلد المشعر والزجاجي3،4،7. لتتبع الألياف العصبية الجلدية على مسافة أطول ، تم تقطيع أنسجة الجلد بسماكة 300 ميكرومتر للتلطيخ الكيميائي المناعي والكيميائي النسيجي ، يليه علاج إزالة الأنسجة. تم استخدام CGRP لتسمية الألياف العصبية الحسية12,13. بالإضافة إلى ذلك ، لتسليط الضوء على الألياف العصبية الجلدية على خلفية الأنسجة ، تم استخدام phalloidin و lymphatic الأوعية البطانية hyaluronan receptor 1 (LYVE1) لتسمية الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية ، على التوالي14,15.
قدمت هذه الأساليب طريقة مباشرة يمكن تطبيقها لإظهار رؤية عالية الدقة للألياف العصبية الجلدية وأيضا لتصور العلاقة المكانية بين الألياف العصبية والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد ، والتي قد توفر المزيد من المعلومات لفهم توازن الجلد الطبيعي والتغيير الجلدي في ظل الظروف المرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة عرضا مفصلا للألياف العصبية الجلدية في الجلد المشعر واللامع باستخدام التألق المناعي على أقسام الأنسجة السميكة مع علاج واضح وعرض 3D لفهم تعصيب الجلد بشكل أفضل. وقت حضانة الأجسام المضادة يصل إلى 1-2 أيام وعملية التنظيف بين عشية وضحاها مهمة. تؤثر هاتان الخطوتان الرئيسيتان بشكل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية صندوق الابتكار (رمز المشروع رقم. CI2021A03404) والصندوق الوطني للابتكار متعدد التخصصات في الطب الصيني التقليدي (رمز المشروع رقم. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
