Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen
Summary
De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.
Abstract
Huid innervatie is een belangrijk onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Hoewel de studie van de huidzenuwvezels snel is gevorderd, komt het grootste deel van het begrip van hun distributieve en chemische kenmerken van conventionele histochemische en immunohistochemische kleuring op dunne weefselsecties. Met de ontwikkeling van de weefselzuiveringstechniek is het mogelijk geworden om de huidzenuwvezels op dikkere weefselsecties te bekijken. Het huidige protocol beschrijft meerdere fluorescerende kleuringen op weefselsecties met een dikte van 300 μm van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van ratten, de twee typische harige en glabreuze huidplaatsen. Hier labelt het calcitonine-gen-gerelateerde peptide de sensorische zenuwvezels, terwijl falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 respectievelijk de bloed- en lymfevaten labelen. Onder een confocale microscoop werden de gelabelde sensorische zenuwvezels volledig op langere afstand gevolgd, lopend in bundels in de diepe cutane laag en freestyle in de oppervlakkige laag. Deze zenuwvezels liepen parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten vormden een driedimensionaal (3D) netwerk in de harige en glazige huid. Het huidige protocol biedt een effectievere benadering voor het bestuderen van de innervatie van de huid dan de bestaande conventionele methoden vanuit het methodologische perspectief.
Introduction
De huid, het grootste orgaan in het lichaam, dat dient als een belangrijke interface naar de omgeving, wordt dicht geïnnerveerd door vele zenuwvezels 1,2,3. Hoewel de innervatie van de huid eerder op grote schaal is bestudeerd met verschillende histologische methoden, zoals kleuring op de huid- en weefselsecties 4,5,6, is de gedetailleerde effectieve demonstratie van huidzenuwvezels nog steeds een uitdaging 7,8. Daarom ontwikkelde het huidige protocol een unieke techniek om cutane zenuwvezels duidelijker te vertonen in het dikke weefselgedeelte.
Vanwege de limiet door de dikte van secties, is de observatie van geïnnerveerde huidzenuwvezels niet nauwkeurig genoeg om de relatie tussen calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) zenuwvezels en lokale weefsels en organen nauwkeurig weer te geven uit de verkregen beeldinformatie. De opkomst van 3D-weefselopruimingstechnologie biedt een haalbare methode om dit probleem op te lossen 9,10. De snelle ontwikkeling van weefselzuiveringsbenaderingen heeft de afgelopen tijd veel hulpmiddelen geboden voor het bestuderen van weefselstructuren, hele organen, neuronale projecties en hele dieren11. Het transparante huidweefsel kan in een veel dikker gedeelte worden afgebeeld door confocale microscopie om de gegevens te verkrijgen om huidzenuwvezels te visualiseren.
In de huidige studie werd de plantaire en dorsale huid van een rat achtervoet geselecteerd als de twee doellocaties van de harige en glabreuze huid 3,4,7. Om de huidzenuwvezels op een langere afstand te traceren, werd het huidweefsel gesneden op de dikte van 300 μm voor immunohistochemische en histochemische kleuring, gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling. CGRP werd gebruikt om de sensorische zenuwvezels12,13 te labelen. Om de huidzenuwvezels op de weefselachtergrond te benadrukken, werden falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 (LYVE1) verder gebruikt om de bloedvaten en lymfevaten te labelen, respectievelijk14,15.
Deze benaderingen leverden een eenvoudige methode op die kan worden toegepast om een hoge resolutiebeeld van de huidzenuwvezels te demonstreren en ook om de ruimtelijke correlatie tussen de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de huid te visualiseren, wat veel meer informatie kan opleveren om de homeostase van de normale huid en de cutane verandering onder de pathologische omstandigheden te begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie biedt een gedetailleerde demonstratie van de huidzenuwvezels in de behaarde en glabrous huid door immunofluorescentie te gebruiken op dikkere weefselsecties met clearingbehandeling en een 3D-weergave om de binnenkant van de huid beter te begrijpen. De antilichaamincubatietijd van maximaal 1-2 dagen en een nachtelijk reinigingsproces zijn belangrijk. Deze twee belangrijke stappen hebben direct invloed op het immunofluorescentiekleuringseffect van dikke delen. Een ander probleem werd opgeworpen door de ke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) en het Nationaal Interdisciplinair Innovatiefonds Traditionele Chinese Geneeskunde (Projectcode nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
