Демонстрация иннервации волосатой и гламурной кожи в 3D-паттерне с использованием нескольких флуоресцентных подходов к окрашиванию и очистке тканей
Summary
Толщина тканевых срезов ограничивала морфологическое исследование иннервации кожи. Настоящий протокол описывает уникальную технику очистки тканей для визуализации кожных нервных волокон в толстых 300 мкм участках ткани под конфокальной микроскопией.
Abstract
Иннервация кожи является важной частью периферической нервной системы. Хотя изучение кожных нервных волокон быстро прогрессировало, большая часть понимания их распределительных и химических характеристик исходит из обычного гистохимического и иммуногистохимического окрашивания тонких участков тканей. С развитием техники очистки тканей стало возможным просматривать кожные нервные волокна на более толстых участках ткани. Настоящий протокол описывает множественные флуоресцентные окрашивания на участках тканей толщиной 300 мкм от подошвенной и дорсальной кожи задних лап крыс, двух типичных волосистых и блестящих участков кожи. Здесь пептид, связанный с геном кальцитонина, маркирует сенсорные нервные волокна, в то время как фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 помечают кровеносные и лимфатические сосуды соответственно. Под конфокальным микроскопом меченые сенсорные нервные волокна полностью отслеживались на более длинной дистанции, бегая пучками в глубоком кожном слое и фристайлом в поверхностном слое. Эти нервные волокна проходили параллельно или окружали кровеносные сосуды, а лимфатические сосуды образовывали трехмерную (3D) сеть в волосатой и блестящей коже. Текущий протокол обеспечивает более эффективный подход к изучению иннервации кожи, чем существующие традиционные методы с точки зрения методологии.
Introduction
Кожа, самый большой орган в организме, служащий ключевым интерфейсом к окружающей среде, плотно иннервируется многими нервными волокнами 1,2,3. Хотя иннервация кожи была широко изучена ранее с помощью различных гистологических методов, таких как окрашивание на цельных участках кожи и тканей 4,5,6, подробная эффективная демонстрация кожных нервных волокон по-прежнему является проблемой 7,8. Учитывая это, настоящий протокол разработал уникальную технику для более четкого отображения кожных нервных волокон в толстом срезе ткани.
Из-за ограничения по толщине срезов наблюдение за иннервированными нервными волокнами кожи недостаточно точно, чтобы точно изобразить взаимосвязь между нервными волокнами, связанными с геном кальцитонина (CGRP), и местными тканями и органами из полученной информации изображения. Появление технологии 3D очистки тканей обеспечивает осуществимый метод решения этой проблемы 9,10. Быстрое развитие подходов к очистке тканей предложило много инструментов для изучения тканевых структур, целых органов, нейронных проекций и целых животных в последнее время11. Прозрачная кожная ткань может быть изображена в гораздо более толстом срезе с помощью конфокальной микроскопии для получения данных для визуализации кожных нервных волокон.
В текущем исследовании подошвенная и спинная кожа задней лапы крысы была выбрана в качестве двух целевых участков волосатой и блестящей кожи 3,4,7. Чтобы проследить кожные нервные волокна на большем расстоянии, кожную ткань разрезали толщиной 300 мкм для иммуногистохимического и гистохимического окрашивания с последующей очисткой тканей. CGRP использовали для маркировки сенсорных нервных волокон12,13. Кроме того, для выделения кожных нервных волокон на тканевом фоне дополнительно использовали фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 (LYVE1) для маркировки кровеносных и лимфатических сосудов соответственно14,15.
Эти подходы обеспечили простой метод, который может быть применен для демонстрации изображения кожных нервных волокон с высоким разрешением, а также для визуализации пространственной корреляции между нервными волокнами, кровеносными сосудами и лимфатическими сосудами в коже, что может предоставить гораздо больше информации для понимания гомеостаза нормальной кожи и изменения кожи в патологических условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование обеспечивает подробную демонстрацию кожных нервных волокон в волосистой и блестящей коже с использованием иммунофлуоресценции на более толстых участках тканей с очищающей обработкой и 3D-видом, чтобы лучше понять иннервацию кожи. Важное значение имеет время ин…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Инновационным фондом Китайской академии медицинских наук (Код проекта No. CI2021A03404) и Национальный междисциплинарный инновационный фонд традиционной китайской медицины (код проекта No. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
