Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati
Summary
Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l’elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un’elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l’elettroporazione.
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficace per isolare gli epatociti primari del topo seguito dalla somministrazione mediata dall’elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine (RNP) e mRNA. Gli epatociti primari di topo sono stati isolati utilizzando un metodo di perfusione retrograda in tre fasi con conseguenti rese elevate fino a 50 × 106 cellule per fegato e vitalità cellulare di >85%. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la placcatura, la colorazione e la coltura degli epatociti. I risultati indicano che l’elettroporazione fornisce un’elevata efficienza di trasfezione dell’89%, misurata dalla percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde (GFP) e dalla modesta vitalità cellulare di >35% negli epatociti di topo.
Per dimostrare l’utilità di questo approccio, CRISPR-Cas9 mirato al gene dell’idrossifenilpiruvato diossigenasi è stato elettroporato in epatociti primari di topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene terapeutico correlato a una malattia metabolica ereditaria (IMD) del fegato. Un editing on-target più elevato del 78% è stato osservato per gli RNP rispetto al 47% di efficienza di editing con mRNA. La funzionalità degli epatociti è stata valutata in vitro utilizzando un test dell’albumina che ha indicato che la somministrazione di CRISPR-Cas9 come RNP e mRNA si traduce in una vitalità cellulare comparabile negli epatociti primari di topo. Un’applicazione promettente per questo protocollo è la generazione di modelli murini per le malattie genetiche umane che colpiscono il fegato.
Introduction
Le IMD del fegato sono malattie genetiche caratterizzate dalla carenza di un enzima epatico cruciale coinvolto nel metabolismo che porta all’accumulo di metaboliti tossici. Senza trattamento, le IMD del fegato provocano insufficienza d’organo o morte prematura 1,2. L’unica opzione curativa per i pazienti con IMD del fegato è il trapianto di fegato ortotopico, che è limitato a causa della scarsa disponibilità di organi donatori e delle complicanze della terapia immunosoppressiva a seguito della procedura 3,4. Secondo i recenti dati raccolti dall’Organ Procurement and Transplantation Network, solo il 40%-46% dei pazienti adulti in lista d’attesa per il trapianto di fegato riceve un organo, mentre il 12,3% di questi pazienti muore mentre è in lista d’attesa5. Inoltre, solo il 5% di tutte le malattie rare del fegato ha un trattamento approvato dalla FDA6. È chiaro che c’è un bisogno critico di nuovi trattamenti per gli IMD del fegato. Tuttavia, sono necessari modelli di malattia appropriati per sviluppare nuove opzioni terapeutiche.
La modellazione delle malattie umane utilizzando sistemi in vitro e in vivo rimane un ostacolo per lo sviluppo di terapie efficaci e lo studio della patologia delle IMD del fegato. Gli epatociti provenienti da pazienti con malattie rare del fegato sono difficili da ottenere7. I modelli animali sono cruciali per sviluppare una comprensione della patologia della malattia e per testare strategie terapeutiche. Tuttavia, un ostacolo è la generazione di modelli da embrioni portatori di mutazioni letali. Ad esempio, i tentativi di creare modelli murini della sindrome di Alagille (ALGS) con embrioni contenenti delezioni omozigoti di una sequenza di 5 kb vicino alla fine 5′-end del gene Jag1 hanno provocato la morte precoce degli embrioni8. Inoltre, la generazione di modelli murini mediante modifica genetica in cellule staminali embrionali può richiedere molto tempo e risorse9. Infine, le mutazioni appariranno al di fuori del tessuto bersaglio, portando a variabili confondenti che possono impedire lo studio della malattia9. L’editing genetico somatico consentirebbe una modifica più semplice nel tessuto epatico e bypasserebbe le sfide associate alla generazione di modelli che utilizzano cellule staminali embrionali.
L’elettroporazione consente la consegna di CRISPR-Cas9 direttamente nel nucleo applicando correnti ad alta tensione per permeabilizzare la membrana cellulare ed è compatibile con molti tipi di cellule, comprese quelle che sono intransigenti alle tecniche di trasfezione, come le cellule staminali embrionali umane, le cellule staminali pluripotenti e i neuroni 10,11,12 . Tuttavia, la bassa redditività è un potenziale svantaggio dell’elettroporazione; l’ottimizzazione della procedura può produrre alti livelli di consegna limitando la tossicità13. Un recente studio dimostra la fattibilità dell’elettroporazione dei componenti CRISPR-Cas9 in epatociti primari di topo e umani come approccio altamente efficiente14. L’elettroporazione ex vivo negli epatociti ha il potenziale per essere applicata per generare nuovi modelli murini per imD umani del fegato.
Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata passo-passo per isolare gli epatociti di topo dal fegato e successivamente elettroporare CRISPR-Cas9 come complessi RNP, costituiti da proteina Cas9 e RNA sintetico a guida singola (sgRNA), o mRNA Cas9 combinato con sgRNA per ottenere alti livelli di editing genico on-target. Inoltre, il protocollo fornisce metodi per quantificare l’efficienza, la vitalità e la funzionalità dell’editing genetico dopo l’elettroporazione di CRISPR-Cas9 in epatociti di topo appena isolati.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi delineati nel protocollo per l’isolamento degli epatociti sono impegnativi e richiedono pratica per la competenza. Ci sono diversi passaggi chiave per il successo dell’isolamento degli epatociti dal fegato. In primo luogo, una corretta cannulazione della vena cava inferiore è essenziale per la completa perfusione epatica. L’assenza di sbiancamento nel fegato dopo la perfusione indica lo spostamento del catetere (Tabella 1). La vena cava inferiore (perfusione retrograda) è stata cannulata nel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC ha ricevuto finanziamenti dal South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) del National Institutes of Health, dall’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation e dall’American Society of Gene & Cell Therapy con i numeri di sovvenzione P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, rispettivamente. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell’American Society of Gene & Cell Therapy o dell’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Lo schema per la Figura 1 è stato creato con BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
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