갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달
Summary
이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.
Abstract
이 프로토콜은 원발성 마우스 간세포를 단리하기 위한 빠르고 효과적인 방법에 이어 리보뉴클레오단백질(RNPs) 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9의 전기천공 매개 전달을 기술한다. 일차 마우스 간세포는 3단계 역행 관류 방법을 사용하여 분리하여 간 당 최대 50 × 10,6 세포의 높은 수율과 >85%의 세포 생존율을 초래하였다. 이 프로토콜은 간세포를 플레이팅, 염색 및 배양하기 위한 상세한 지침을 제공합니다. 결과는 전기천공이 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포의 백분율로 측정되는 89%의 높은 형질감염 효율과 마우스 간세포에서 >35%의 겸손한 세포 생존율을 제공한다는 것을 나타낸다.
이러한 접근법의 유용성을 입증하기 위해, 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 유전자를 표적화하는 CRISPR-Cas9를 원발성 마우스 간세포 내로 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환(IMD)과 관련된 치료 유전자를 교란시키는 원리 증명 유전자 편집으로서 하였다. mRNA를 사용한 47% 편집 효율에 비해 RNP에 대해 78%의 더 높은 온-타겟 편집이 관찰되었다. 간세포의 기능성은 RNP 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전달하는 것이 원발성 마우스 간세포에서 필적할만한 세포 생존율을 초래한다는 것을 나타내는 알부민 검정을 사용하여 시험관내에서 평가되었다. 이 프로토콜에 대한 유망한 응용 프로그램은 간에 영향을 미치는 인간 유전 질환에 대한 마우스 모델의 생성입니다.
Introduction
간장의 IMD는 독성 대사 산물의 축적으로 이어지는 신진 대사에 관여하는 중요한 간 효소의 결핍을 특징으로하는 유전 질환입니다. 치료를받지 않으면 간 IMD가 장기 부전 또는 조기 사망 1,2를 초래합니다. 간장의 IMD 환자를위한 유일한 치료 옵션은 동종 외과 간 이식이며, 이는 기증자 장기의 낮은 가용성과 절차 3,4 이후의 면역 억제 요법으로 인한 합병증으로 인해 제한됩니다. 장기 조달 및 이식 네트워크에 의해 수집 된 최근 데이터에 따르면, 간 이식 대기자 명단에있는 성인 환자의 40 % -46 %만이 장기를 받고,이 환자의 12.3 %는 대기자 명단5에있는 동안 사망합니다. 또한, 모든 희귀 간 질환 중 5 %만이 FDA가 승인 한 치료법을 가지고 있습니다6. 간 IMD에 대한 새로운 치료법이 절실히 필요하다는 것은 분명합니다. 그러나 새로운 치료 옵션을 개발하기 위해서는 적절한 질병 모델이 필요합니다.
시험관 내 및 생체 내 시스템을 사용하여 인간 질병을 모델링하는 것은 효과적인 치료법을 개발하고 간 IMD의 병리학을 연구하는 데 장애물로 남아 있습니다. 희귀 간 질환 환자의 간세포는7을 얻기가 어렵습니다. 동물 모델은 질병 병리학에 대한 이해를 개발하고 치료 전략을 테스트하는 데 중요합니다. 그러나 한 가지 장애물은 치명적인 돌연변이를 가진 배아에서 모델을 생성하는 것입니다. 예를 들어, Jag1 유전자의 5′-말단 근처에서 5 kb 서열의 동형접합성 결실을 포함하는 배아를 갖는 알라길 증후군 (ALGS)의 마우스 모델을 생성하려는 시도는 배아8의 조기 사망을 초래하였다. 또한, 배아 줄기 세포에서 유전자 편집에 의해 마우스 모델을 생성하는 것은 시간-집약적 및 자원-집약적일 수 있다9. 마지막으로, 돌연변이는 표적 조직 외부에 나타나 질병의 연구를 방해 할 수있는 혼란스러운 변수로 이어질 것입니다9. 체세포 유전자 편집은 간 조직에서 더 쉽게 편집 할 수있게하고 배아 줄기 세포를 사용하여 모델을 생성하는 것과 관련된 문제를 우회합니다.
전기천공은 세포막에 침투하기 위해 고전압 전류를 인가함으로써 CRISPR-Cas9를 핵으로 직접 전달할 수 있게 해주며, 인간 배아줄기세포, 다능성 줄기세포 및 뉴런 10,11,12와 같은 형질감염 기술에 비타협적인 것을 포함한 많은 세포 유형과 양립할 수 있다10,11,12 . 그러나, 낮은 생존력은 전기천공의 잠재적인 단점이다; 절차를 최적화하면 독성을 제한하면서 높은 수준의 전달을 얻을 수 있습니다13. 최근의 연구는 CRISPR-Cas9 성분을 일차 마우스 및 인간 간세포로 전기천공하는 것이 매우 효율적인 접근법으로서 실현 가능성을 입증한다14. 간세포에서의 생체외 전기천공은 간세포의 인간 IMDs에 대한 새로운 마우스 모델을 생성하는데 적용될 수 있는 잠재력을 갖는다.
이 프로토콜은 마우스 간세포를 간세포로부터 단리하고 이어서 Cas9 단백질 및 합성 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 sgRNA와 결합 된 Cas9 mRNA로 구성된 RNP 복합체로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 높은 수준의 표적 유전자 편집을 얻기 위한 상세한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 갓 분리된 마우스 간세포로의 CRISPR-Cas9의 전기천공에 따른 유전자 편집 효율, 생존력 및 기능성을 정량화하는 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간세포 격리를위한 프로토콜에 설명 된 단계는 도전적이며 숙련도를위한 연습이 필요합니다. 간에서 성공적인 간세포 분리를위한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 열등한 정맥 카바의 적절한 통조림은 완전한 간 관류에 필수적입니다. 관류 후 간에서 블랜칭이 없다는 것은 카테터의 변위를 나타냅니다 (표 1). 열등한 정맥 카바 (역행 관류)는 포털 정맥 (antegrade perfusion)보다 간단?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC는 사우스 캐롤라이나 생명 공학 센터 재생 및 Tissues 형성 파일럿 보조금 국립 보건원 (National Institutes of General Medical Sciences)의 NIGMS, 미국 간 질환 연구 협회 재단 및 미국 유전자 및 세포 치료 협회 (American Society of Gene & Cell Therapy)가 지원하는 보조금 번호 P30 GM131959, 2021000920, 및 2022000099 각각. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 유전자 및 세포 치료 협회 또는 미국 간 질환 연구 재단 협회의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 의 회로도는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
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