Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi
Summary
Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9’u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.
Abstract
Bu protokol, primer fare hepatositlerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntemi ve ardından CRISPR-Cas9’un ribonükleoproteinler (RNP’ler) ve mRNA olarak elektroporasyon aracılı olarak verilmesini açıklar. Primer fare hepatositleri, karaciğer başına 50 × 106 hücreye kadar yüksek verim ve% >85 hücre canlılığı ile sonuçlanan üç aşamalı retrograd perfüzyon yöntemi kullanılarak izole edildi. Bu protokol, hepatositlerin kaplanması, boyanması ve kültürlenmesi için ayrıntılı talimatlar sağlar. Sonuçlar, elektroporasyonun, yeşil floresan protein (GFP)-pozitif hücrelerin yüzdesi ve fare hepatositlerinde% >35’lik mütevazı hücre canlılığı ile ölçüldüğü gibi% 89’luk yüksek bir transfeksiyon verimliliği sağladığını göstermektedir.
Bu yaklaşımın yararlılığını göstermek için, hidroksifenilpiruvat dioksijenaz genini hedef alan CRISPR-Cas9, karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı (IMD) ile ilgili terapötik bir geni bozmak için prensip kanıtı gen düzenlemesi olarak birincil fare hepatositlerine elektroporate edildi. RNP’ler için% 78’lik daha yüksek bir hedef üzerinde düzenleme, mRNA ile% 47 düzenleme verimliliğine kıyasla gözlenmiştir. Hepatositlerin işlevselliği, CRISPR-Cas9’un RNP’ler ve mRNA olarak verilmesinin, primer fare hepatositlerinde karşılaştırılabilir hücre canlılığı ile sonuçlandığını gösteren bir albümin testi kullanılarak in vitro olarak değerlendirildi. Bu protokol için umut verici bir uygulama, karaciğeri etkileyen insan genetik hastalıkları için fare modellerinin üretilmesidir.
Introduction
Karaciğerin IMD’leri, toksik metabolitlerin birikmesine yol açan metabolizmada rol oynayan çok önemli bir hepatik enzimin eksikliği ile karakterize genetik bozukluklardır. Tedavi olmadan, karaciğerin IMD’leri organ yetmezliği veya erken ölümle sonuçlanır 1,2. Karaciğer IMD’leri olan hastalar için tek küratif seçenek, donör organların düşük mevcudiyeti ve prosedürü takiben immünsüpresif tedaviden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle sınırlı olan ortopik karaciğer transplantasyonudur 3,4. Organ Tedarik ve Transplantasyon Ağı tarafından toplanan son verilere göre, karaciğer nakli bekleme listesindeki yetişkin hastaların sadece% 40-46’sı bir organ alırken, bu hastaların% 12.3’ü bekleme listesindeyken ölmektedir5. Ayrıca, tüm nadir karaciğer hastalıklarının sadece% 5’inde FDA onaylı bir tedavivardır 6. Karaciğerin IMD’leri için yeni tedavilere kritik bir ihtiyaç olduğu açıktır. Bununla birlikte, yeni tedavi seçenekleri geliştirmek için uygun hastalık modelleri gereklidir.
İn vitro ve in vivo sistemleri kullanarak insan hastalıklarının modellenmesi, etkili tedavilerin geliştirilmesi ve karaciğerin IMD’lerinin patolojisinin incelenmesi için bir engel olmaya devam etmektedir. Nadir karaciğer hastalığı olan hastalardan hepatositlerin elde edilmesi zordur7. Hayvan modelleri, hastalık patolojisi hakkında bir anlayış geliştirmek ve terapötik stratejileri test etmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bir engel, ölümcül mutasyonlar taşıyan embriyolardan modeller üretmektir. Örneğin, Jag1 geninin 5′ ucuna yakın 5 kb’lik bir dizinin homozigot delesyonlarını içeren embriyolarla Alagille Sendromu’nun (ALGS) fare modellerini oluşturma girişimleri, embriyoların erken ölümüyle sonuçlandı8. Ek olarak, embriyonik kök hücrelerde gen düzenleme ile fare modelleri oluşturmak zaman ve kaynak yoğunolabilir 9. Son olarak, mutasyonlar hedeflenen dokunun dışında ortaya çıkacak ve hastalığın incelenmesini engelleyebilecek kafa karıştırıcı değişkenlere yol açacaktır9. Somatik gen düzenleme, karaciğer dokusunda daha kolay düzenlemeye izin verir ve embriyonik kök hücreleri kullanarak modeller üretmekle ilgili zorlukları atlar.
Elektroporasyon, hücre zarını geçirgenleştirmek için yüksek voltajlı akımlar uygulayarak CRISPR-Cas9’un doğrudan çekirdeğe verilmesini sağlar ve insan embriyonik kök hücreleri, pluripotent kök hücreler ve nöronlar gibi transfeksiyon tekniklerine aykırı olanlar da dahil olmak üzere birçok hücre tipiyle uyumludur10,11,12 . Bununla birlikte, düşük canlılık, elektroporasyonun potansiyel bir dezavantajıdır; prosedürün optimize edilmesi, toksisiteyi sınırlarken yüksek düzeyde doğum sağlayabilir13. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, CRISPR-Cas9 bileşenlerinin birincil fare ve insan hepatositlerine elektroporasyonunun fizibilitesini oldukça verimli bir yaklaşım olarak göstermektedir14. Hepatositlerde Ex vivo elektroporasyon, karaciğerin insan IMD’leri için yeni fare modelleri üretmek için uygulanma potansiyeline sahiptir.
Bu protokol, fare hepatositlerini karaciğerden izole etmek ve daha sonra Cas9 proteini ve sentetik tek kılavuzlu RNA’dan (sgRNA) oluşan RNP kompleksleri olarak CRISPR-Cas9’u elektroporize etmek için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar veya Cas9 mRNA, yüksek düzeyde hedef gen düzenlemesi elde etmek için sgRNA ile birleştirilmiştir. Ek olarak, protokol, CRISPR-Cas9’un yeni izole edilmiş fare hepatositlerine elektroporasyonunu takiben gen düzenleme verimliliğini, canlılığını ve işlevselliğini ölçmek için yöntemler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatosit izolasyonu protokolünde belirtilen adımlar zordur ve yeterlilik için pratik gerektirir. Karaciğerden başarılı hepatosit izolasyonu için birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, inferior vena kavanın uygun şekilde kanülasyonu tam karaciğer perfüzyonu için gereklidir. Perfüzyon sonrası karaciğerde beyazlatma olmaması kateterin yer değiştirmesini gösterir (Tablo 1). İnferior vena kava (retrograd perfüzyon) portal venden (antegrad perfüzyon) daha basit ve daha erişilebil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Derneği Vakfı ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği tarafından desteklenen Güney Carolina Biyomühendislik Rejenerasyon ve Doku Oluşumu Merkezi Pilot hibesinden P30 GM131959, 2021000920 hibe numaraları altında fon aldı. ve sırasıyla 2022000099. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Amerikan Karaciğer Hastalıkları Çalışmaları Vakfı’nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Şekil 1’in şeması BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
References
- Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
- Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
- Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
- Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
- . OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019)
- Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
- Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
- Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
- . Benchling [Biology Software] Available from: https://benchling.com (2022)
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
- Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
- Grompe, M., Tanguay, R. M. . Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. , 215-230 (2017).
