تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9
Summary
توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.
Abstract
تشكل البيئة الخلوية المعقدة تحديات لتحليل حركية الجزيء الواحد. ومع ذلك ، فقد أدى التقدم في تقنيات التصوير إلى تحسين دراسات الجزيء الواحد واكتسب شعبية هائلة في اكتشاف وفهم السلوك الديناميكي للجزيئات الموسومة بالفلورسنت. هنا ، نصف طريقة مفصلة للدراسات أحادية الجزيء في المختبر لمحركات عائلة kinesin-3 باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). Kinesin-3 هي عائلة كبيرة تلعب أدوارا حاسمة في الوظائف الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من نقل البضائع داخل الخلايا إلى انقسام الخلايا إلى التنمية. لقد أظهرنا سابقا أن محركات ثنائي الحركة 3 النشطة بشكل أساسي تظهر حركية سريعة وفائقة المعالجة مع تقارب عالي للأنابيب الدقيقة على مستوى الجزيء الواحد باستخدام محللات الخلايا المحضرة عن طريق التعبير عن المحرك في خلايا الثدييات. يدرس مختبرنا محركات kinesin-3 وآلياتها التنظيمية باستخدام الأساليب الخلوية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية ، وتتطلب مثل هذه الدراسات بروتينات نقية على نطاق واسع. سيكون التعبير عن هذه المحركات وتنقيتها باستخدام خلايا الثدييات مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، في حين أن التعبير في نظام التعبير بدائي النواة أدى إلى بروتين مجمع وغير نشط بشكل كبير. للتغلب على القيود التي تفرضها أنظمة تنقية البكتيريا وتحلل خلايا الثدييات ، أنشأنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها. محركات kinesin-3 موسومة بشكل نهائي C ببروتينات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCitirine أو 3xmCit) توفر إشارات محسنة وتقلل من التبييض الضوئي. في المختبر ، يوضح تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات للبروتينات المنقاة Sf9 أن محركات kinesin-3 سريعة وفائقة المعالجة تشبه دراساتنا السابقة باستخدام تحلل خلايا الثدييات. تشمل التطبيقات الأخرى التي تستخدم هذه المقايسات المعرفة التفصيلية لظروف oligomer للمحركات ، وشركاء الربط المحددين الموازين للدراسات الكيميائية الحيوية ، وحالتهم الحركية.
Introduction
تشكل بيئة الخلية المزدحمة للغاية العديد من التحديات في فرز البروتينات والجزيئات المتجهة. يتم تسهيل عبء العمل المكثف للتنظيم والتوزيع الزماني المكاني للجزيئات داخل السيتوبلازم بواسطة المحركات الجزيئية والمسارات الهيكلية الخلوية. المحركات الجزيئية هي الإنزيمات التي تحلل عملات الطاقة مثل ATP وتستخدم تلك الطاقة أثناء الحركة وتوليد القوة1. بناء على تشابه تسلسل الأحماض الأمينية ، يتم تجميع الكينيسين في 14 عائلة وعلى الرغم من هذا التشابه ، يساهم كل محرك بشكل فريد في عمل الخلية. تشكل محركات عائلة Kinesin-3 واحدة من أكبر المحركات ، وتضم خمس عائلات فرعية (KIF1 و KIF13 و KIF14 و KIF16 و KIF28) 2 ، المرتبطة بوظائف خلوية وفسيولوجية متنوعة ، بما في ذلك نقل الحويصلة ، والإشارات ، والانقسام ، والهجرة النووية ، والتنمية 3،4،5. ضعف في وظيفة النقل kinesin-3 متورط في العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية ، وعيوب النمو ، وأمراض السرطان6،7،8،9.
أظهرت الأعمال الحديثة أن محركات kinesin-3 هي مونومرات ولكنها تخضع للتثبيط الناجم عن البضائع وتؤدي إلى حركة سريعة وفائقة المعالجة مقارنة بالكينيسينالتقليدي 10،11،12،13. يحتاج توصيفها البيوكيميائي والفيزيائي الحيوي إلى كمية كبيرة من البروتينات النقية النشطة. ومع ذلك ، أدى إنتاجها في نظام التعبير بدائي النواة إلى محركات غير نشطة أو مجمعة ، على الأرجح بسبب تخليق البروتين غير المتوافق ، وآلات الطي والتعديل14،15،16،17،18. للتحايل على هذه القيود وزيادة العائد ، أنشأنا هنا نظام تعبير قوي عن فيروس Sf9-baculovirus للتعبير عن هذه المحركات وتنقيتها.
يستخدم نظام تعبير الفيروس البقعي خطوط خلايا الحشرات Sf9 كنظام مضيف لتعبير البروتين المؤتلف حقيقي النواة عالي الإنتاجية19,20. يمتلك Baculovirus محفزا قويا متعدد السطوح يساعد في التعبير الجيني غير المتجانس وإنتاج البروتينات المؤتلفة القابلة للذوبان17. نظرا لفعاليتها من حيث التكلفة وآمنة في التعامل معها وكمية عالية من تعبير البروتين النشط ، فقد أصبحت أداة قوية21. للتعبير عن البروتين محل الاهتمام ، تتمثل الخطوة الرئيسية في توليد باكميد مؤتلف. نظرا لأن مجموعات توليد bacmid المتاحة تجاريا باهظة الثمن وسنعمل مع المزيد من العينات ، فقد طورنا بروتوكولا داخليا لكل من الإدخالات الكبيرة والصغيرة لمحركات kinesin-3 في bacmids. تم استخدام محركات kinesin-3 المنقى Sf9 لتوصيف خصائص انزلاق الأنابيب الدقيقة أحادية الجزيء ومتعددة المحركات في المختبر باستخدام الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF). يتم تمييز المحركات بشكل نهائي C بجزيئات فلورية ترادفية ثلاثية (3xmCit) لتوفير إشارة محسنة وتقليل التبييض الضوئي. نظرا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، والسمية الضوئية الأقل ، والتصوير الانتقائي لمنطقة صغيرة جدا بالقرب من الغطاء ، فقد تم استخدام تصوير TIRF على نطاق واسع لتصور ديناميكيات البروتين على مستوى الجزيء الواحد في الجسم الحي وفي المختبر.
تناقش هذه الدراسة تنقية محركات kinesin-3 من خلال استخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 والتصوير أحادي الجزيء في المختبر وتحليل الانزلاق متعدد المحركات باستخدام الفحص المجهري TIRF. إجمالا ، تظهر هذه الدراسة أن خصائص الحركة للمحركات المنقاة Sf9 متطابقة مع خصائص المحركات المحضرة من محللات خلايا الثدييات. ومن ثم ، نعتقد أنه يمكن تكييف نظام Sf9-baculovirus للتعبير عن أي بروتين حركي مهم وتنقيته.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9 أحد أكثر الطرق تنوعا ونجاحا لإنتاج البروتين عالي الإنتاجية19،36،37. قدرة التعديل بعد الترجمة لخلايا Sf9 قابلة للمقارنة إلى حد كبير مع نظام الثدييات15. عيب كبير في استخدام هذا النظام هو أنه بطي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر V.S. و PS البروفيسور كريستين ج. فيرهي (جامعة ميشيغان ، آن أربور ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية) والبروفيسور روب ماليك (المعهد الهندي للتكنولوجيا في بومباي (IITB) ، مومباي ، الهند) على دعمهم غير المشروط طوال فترة الدراسة. ملاحظة تشكر الدكتورة سيفابريا كيروباكاران على دعمها طوال المشروع. تقر V.S. بالتمويل من خلال DBT (رقم المنحة: BT / PR15214 / BRB / 10/1449/2015 و BT / RLF / Re-entry / 45/2015) و DST-SERB (رقم المنحة: ECR / 2016 / 000913). تقر P.K.N بتمويل ICMR (المنحة رقم 5/13/13/2019 / NCD-III). PS تقر بالتمويل من DST (رقم المنحة: SR / WOS-A / LS-73/2017). يعترف D.J.S بالزمالة من IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
