Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9
Summary
Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L’analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.
Abstract
Un ambiente cellulare complesso pone sfide per l’analisi della motilità di singole molecole. Tuttavia, i progressi nelle tecniche di imaging hanno migliorato gli studi sulle singole molecole e hanno guadagnato un’immensa popolarità nel rilevare e comprendere il comportamento dinamico delle molecole marcate con fluorescenza. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per studi in vitro a singola molecola di motori della famiglia kinesin-3 utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Kinesin-3 è una grande famiglia che svolge ruoli critici nelle funzioni cellulari e fisiologiche che vanno dal trasporto intracellulare del carico alla divisione cellulare allo sviluppo. Abbiamo dimostrato in precedenza che i motori della chinesina-3 dimerica costitutivamente attivi mostrano una motilità veloce e superprocessiva con elevata affinità microtubulare a livello di singola molecola utilizzando lisati cellulari preparati esprimendo motori in cellule di mammifero. Il nostro laboratorio studia i motori della chinesina-3 e i loro meccanismi di regolazione utilizzando approcci cellulari, biochimici e biofisici, e tali studi richiedono proteine purificate su larga scala. L’espressione e la purificazione di questi motori utilizzando cellule di mammifero sarebbe costosa e richiederebbe molto tempo, mentre l’espressione in un sistema di espressione procariotica ha portato a proteine significativamente aggregate e inattive. Per superare i limiti posti dai sistemi di purificazione batterica e dal lisato cellulare di mammifero, abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori. I motori kinesin-3 sono marcati C-terminalmente con proteine fluorescenti 3-tandem (3xmCitirine o 3xmCit) che forniscono segnali potenziati e diminuzione del fotosbiancamento. L’analisi in vitro di scorrimento a singola molecola e multimotore di proteine purificate Sf9 dimostra che i motori della kinesina-3 sono veloci e superprocessivi simili ai nostri studi precedenti che utilizzano lisati cellulari di mammifero. Altre applicazioni che utilizzano questi saggi includono una conoscenza dettagliata delle condizioni oligomeriche dei motori, partner di legame specifici paralleli agli studi biochimici e il loro stato cinetico.
Introduction
Un ambiente cellulare immensamente affollato pone molte sfide nella selezione di proteine e molecole destinate. Questo intenso carico di lavoro di organizzazione e distribuzione spaziotemporale delle molecole all’interno del citoplasma è facilitato dai motori molecolari e dalle tracce citoscheletriche. I motori molecolari sono gli enzimi che idrolizzano le valute energetiche come l’ATP e utilizzano quell’energia durante la generazione di movimento e forza1. Sulla base della somiglianza della sequenza di aminoacidi, le chinesine sono raggruppate in 14 famiglie e, nonostante questa somiglianza, ogni motore contribuisce in modo univoco al funzionamento di una cellula. I motori della famiglia Kinesin-3 costituiscono uno dei più grandi, comprendente cinque sottofamiglie (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)2, associate a diverse funzioni cellulari e fisiologiche, tra cui il trasporto delle vescicole, la segnalazione, la mitosi, la migrazione nucleare e lo sviluppo 3,4,5. La compromissione della funzione di trasporto della chinesina-3 è implicata in molti disturbi neurodegenerativi, difetti dello sviluppo e malattie tumorali 6,7,8,9.
Recenti lavori hanno dimostrato che i motori della chinesina-3 sono monomeri ma subiscono una dimerizzazione indotta dal carico e determinano una motilità rapida e superprocessiva rispetto alla chinesina convenzionale10,11,12,13. La loro caratterizzazione biochimica e biofisica richiede una grande quantità di proteine attive purificate. Tuttavia, la loro produzione nel sistema di espressione procariotica ha portato a motori inattivi o aggregati, presumibilmente a causa di incompatibili meccanismi di sintesi proteica, ripiegamento e modifica 14,15,16,17,18. Per aggirare tali limitazioni e aumentare la resa, qui abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori.
Il sistema di espressione del baculovirus utilizza linee cellulari di insetti Sf9 come sistema ospite per l’espressione della proteina ricombinante eucariotica ad alto rendimento 19,20. Il baculovirus possiede un forte promotore della poliedrina che assiste nell’espressione genica eterologa e nella produzione di proteine ricombinanti solubili17. Grazie alla sua economicità, alla sicurezza da maneggiare e all’elevata quantità di espressione proteica attiva, è diventato uno strumento potente21. Per esprimere una proteina di interesse, un passo fondamentale è generare un bacmide ricombinante. Poiché i kit di generazione di bacmidi disponibili in commercio sono costosi e lavoreremo con più campioni, abbiamo sviluppato un protocollo interno per inserti grandi e piccoli di motori kinesin-3 nei batteridi. I motori kinesin-3 purificati con sf9 sono stati utilizzati per caratterizzare in vitro le proprietà di scorrimento dei microtubuli a singola molecola e multimotore utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). I motori sono marcati C-terminalmente con molecole fluorescenti a 3 tandem (3xmCit) per fornire un segnale migliorato e una riduzione del fotosbiancamento. Grazie al suo maggiore rapporto segnale-rumore, alla minore fototossicità e all’imaging selettivo di un’area molto piccola vicino al vetrino, l’imaging TIRF è stato ampiamente utilizzato per visualizzare la dinamica delle proteine a livello di singola molecola in vivo e in vitro.
Questo studio discute la purificazione dei motori kinesin-3 impiegando il sistema di espressione del baculovirus Sf9 e l’imaging a singola molecola in vitro e l’analisi multi-motore dei motori utilizzando la microscopia TIRF. Nel complesso, questo studio mostra che le proprietà di motilità dei motori purificati Sf9 sono identiche a quelle dei motori preparati da lisati cellulari di mammifero. Pertanto, riteniamo che il sistema Sf9-baculovirus possa essere adattato per esprimere e purificare qualsiasi proteina motoria di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di espressione del baculovirus Sf9 è uno dei metodi più versatili e di successo per la produzione di proteine ad alto rendimento 19,36,37. La capacità di modificazione post-traduzionale delle cellule Sf9 è altamente paragonabile al sistema dei mammiferi15. Uno svantaggio considerevole dell’utilizzo di questo sistema è che è lento e sensibile alla contaminazione. Uno dei passaggi più crit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. e P.S. ringraziano il Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) e il Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) per il loro sostegno incondizionato durante lo studio. P.S. ringrazia la dottoressa Sivapriya Kirubakaran per il suo supporto durante tutto il progetto. V.S. riconosce il finanziamento tramite DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 e BT/RLF/Re-entry/45/2015) e DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N riconosce ICMR per il finanziamento (sovvenzione n. 5/13/13/2019 / NCD-III). P.S. riconosce il finanziamento dell’ora legale (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S riconosce la fellowship di IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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