Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9
Summary
Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.
Abstract
Un entorno celular complejo plantea desafíos para el análisis de la motilidad de una sola molécula. Sin embargo, el avance en las técnicas de imagen ha mejorado los estudios de una sola molécula y ha ganado una inmensa popularidad en la detección y comprensión del comportamiento dinámico de las moléculas marcadas con fluorescencia. Aquí, describimos un método detallado para estudios in vitro de moléculas individuales de motores de la familia kinesina-3 utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). La quinesina-3 es una gran familia que desempeña funciones críticas en las funciones celulares y fisiológicas que van desde el transporte de carga intracelular hasta la división celular y el desarrollo. Hemos demostrado previamente que los motores de quinesina-3 dimérica constitutivamente activos exhiben una motilidad rápida y superprocesiva con alta afinidad de microtúbulos a nivel de molécula única utilizando lisados celulares preparados expresando motor en células de mamíferos. Nuestro laboratorio estudia los motores de quinesina-3 y sus mecanismos reguladores utilizando enfoques celulares, bioquímicos y biofísicos, y tales estudios exigen proteínas purificadas a gran escala. La expresión y purificación de estos motores utilizando células de mamíferos sería costosa y llevaría mucho tiempo, mientras que la expresión en un sistema de expresión procariota daría como resultado proteínas significativamente agregadas e inactivas. Para superar las limitaciones planteadas por los sistemas de purificación bacteriana y el lisado de células de mamíferos, hemos establecido un robusto sistema de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores. Los motores de quinesina-3 están marcados C-terminalmente con proteínas fluorescentes de 3-tándem (3xmCitirine o 3xmCit) que proporcionan señales mejoradas y disminución del fotoblanqueo. El análisis de deslizamiento in vitro de moléculas individuales y múltiples motores de proteínas purificadas con Sf9 demuestra que los motores de quinesina-3 son rápidos y superprocesales similares a nuestros estudios previos utilizando lisados de células de mamíferos. Otras aplicaciones que utilizan estos ensayos incluyen el conocimiento detallado de las condiciones de oligómeros de los motores, socios de unión específicos en paralelo a estudios bioquímicos y su estado cinético.
Introduction
Un entorno celular inmensamente abarrotado plantea muchos desafíos en la clasificación de proteínas y moléculas destinadas. Esta intensa carga de trabajo de organización y distribución espaciotemporal de moléculas dentro del citoplasma se ve facilitada por motores moleculares y pistas citoesqueléticas. Los motores moleculares son las enzimas que hidrolizan las monedas de energía como el ATP y utilizan esa energía durante el movimiento y la generación de fuerza1. Según la similitud de la secuencia de aminoácidos, las quinesinas se agrupan en 14 familias y, a pesar de esta similitud, cada motor contribuye de manera única al funcionamiento de una célula. Los motores de la familia Kinesin-3 constituyen uno de los más grandes, comprendiendo cinco subfamilias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 y KIF28)2, asociadas con diversas funciones celulares y fisiológicas, incluyendo transporte de vesículas, señalización, mitosis, migración nuclear y desarrollo 3,4,5. El deterioro en la función de transporte de quinesina-3 implica en muchos trastornos neurodegenerativos, defectos del desarrollo y enfermedades cancerosas 6,7,8,9.
Trabajos recientes han demostrado que los motores de quinesina-3 son monómeros pero sufren dimerización inducida por la carga y dan como resultado una motilidad rápida y superprocesiva en comparación con la quinesinaconvencional 10,11,12,13. Su caracterización bioquímica y biofísica necesita una gran cantidad de proteínas activas purificadas. Sin embargo, su producción en el sistema de expresión procariota resultó en motores inactivos o agregados, presumiblemente debido a la incompatibilidad de la maquinaria de síntesis, plegamiento y modificación de proteínas 14,15,16,17,18. Para eludir tales limitaciones y aumentar el rendimiento, aquí hemos establecido un sistema robusto de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores.
El sistema de expresión de baculovirus utiliza líneas celulares de insectos Sf9 como sistema huésped para la expresión de proteínas recombinantes eucariotas de alto rendimiento 19,20. El baculovirus posee un fuerte promotor de poliedrina que ayuda en la expresión génica heteróloga y en la producción de proteínas recombinantes solubles17. Debido a su costo-efectividad, seguro de manejar y alta cantidad de expresión de proteínas activas, se ha convertido en una poderosa herramienta21. Para expresar una proteína de interés, un paso clave es generar una bacmid recombinante. Dado que los kits de generación de bacmid disponibles comercialmente son caros y trabajaremos con más muestras, desarrollamos un protocolo interno para insertos grandes y pequeños de motores de kinesina-3 en bacmids. Se utilizaron motores de quinesina-3 purificados con SF9 para caracterizar in vitro las propiedades de deslizamiento de microtúbulos de una sola molécula y multimotor utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Los motores están marcados C-terminalmente con moléculas fluorescentes de 3 tándem (3xmCit) para proporcionar una señal mejorada y una disminución del fotoblanqueo. Debido a su mayor relación señal-ruido, menos fototoxicidad e imágenes selectivas de un área muy pequeña cerca del cubreobjetos, las imágenes TIRF se han utilizado ampliamente para visualizar la dinámica de proteínas a nivel de molécula única in vivo e in vitro.
Este estudio discute la purificación de motores de quinesina-3 mediante el empleo del sistema de expresión de baculovirus Sf9 y el análisis in vitro de imágenes de molécula única y deslizamiento multimotor de motores utilizando microscopía TIRF. En conjunto, este estudio muestra que las propiedades de motilidad de los motores purificados Sf9 son idénticas a las de los motores preparados a partir de lisados celulares de mamíferos. Por lo tanto, creemos que el sistema Sf9-baculovirus se puede adaptar para expresar y purificar cualquier proteína motora de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de expresión de baculovirus Sf9 es uno de los métodos más versátiles y exitosos para la producción de proteínas de alto rendimiento 19,36,37. La capacidad de modificación postraduccional de las células Sf9 es altamente comparable al sistema de mamíferos15. Una desventaja considerable de usar este sistema es que es lento y sensible a la contaminación. Uno de los pasos más críticos es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. y P.S. agradecen a la Prof. Kristen J. Verhey (Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EUA) y al Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) por su apoyo incondicional durante todo el estudio. P.S. agradece a la Dra. Sivapriya Kirubakaran por su apoyo durante todo el proyecto. V.S. reconoce la financiación a través de DBT (Subvención No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 y BT/RLF/Reentry/45/2015) y DST-SERB (Subvención No.: ECR/2016/000913). P.K.N reconoce al ICMR por su financiación (Subvención No. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconoce la financiación del horario de verano (Subvención No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S reconoce la beca de IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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