현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리
Summary
수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.
Abstract
시퀀싱 기술의 광범위한 적용으로 모기를 포함한 절지동물에서 많은 새로운 바이러스 유사 서열이 발견되었습니다. 이러한 새로운 모기 관련 바이러스의 두 가지 주요 범주는 “모기 매개 바이러스(MBV)”와 “모기 특이 바이러스(MSV)”입니다. 이 새로운 바이러스는 척추동물과 모기 모두에 병원성일 수도 있고 모기와 공생할 수도 있습니다. 엔티티 바이러스는 이러한 바이러스의 생물학적 특성을 확인하는 데 필수적입니다. 따라서, 현장에서 채취한 모기로부터 바이러스 분리 및 증폭을 위한 상세한 프로토콜이 여기에 설명되었다. 먼저, 모기 샘플을 모기 균질액의 상청액으로 제조하였다. 2회 원심분리 후, 상층액을 바이러스 증폭을 위해 모기 세포주 C6/36 또는 척추동물 세포주 BHK-21에 접종하였다. 7일 후, 상청액을 P1 상청액으로서 수집하고, -80°C에서 보관하였다. 다음으로, P1 상청액을 C6/36 또는 BHK-21 세포에 2회 더 계대배양하면서 세포 상태를 매일 확인했습니다. 세포에 대한 세포병리학적 효과(CPE)가 발견되었을 때, 이러한 상청액을 수집하여 바이러스를 식별하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜은 MBV 및 MSV를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초 역할을 합니다.
Introduction
모기는 중요한 병원성 절지 동물 벡터 그룹입니다. Culicidae 1,2과에는 약 3,500 종의 모기가 있습니다. 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발로 인해 세계 여러 지역의 모기에서 바이러스와 유사한 새로운 염기서열이 많이 발견되었습니다3. 일반적으로 이러한 모기 관련 바이러스는 MBV와 MSV의 두 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.
MBV는 황열병 바이러스(YFV), 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 리프트 밸리 열병 바이러스(RVFV)와 같은 많은 인간 또는 동물 질병의 원인 물질인 다양한 바이러스 그룹입니다4. 그들은 전 세계의 인간과 동물 모두에게 심각한 이환율과 사망률을 유발하여 공중 보건을 심각하게 위협했습니다. MBV는 감염된 모기에서 순진한 숙주로, 바이러스에 감염된 숙주와 먹이를 먹는 모기로 전염됨으로써 다양한 숙주 간의 수명 주기를 자연적으로 유지한다5. 따라서 이러한 바이러스는 실험실에서 모기 세포주와 척추동물 세포주를 모두 감염시킬 수 있다1.
이창 바이러스(Yichang virus, YCN), 쿨렉스 플라비바이러스(Culex flavivirus, CxFV) 및 차오양 바이러스(Chaoyang virus, CHAOV)를 포함하는 MSV는 곤충 특이적 바이러스의 하위군이다 1,6,7. 최근 몇 년 동안 새로운 MSV의 발견이 증가했으며 이러한 MSV 중 일부는 MBV의 전송에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 예를 들어, Culex pipiens에서 지속적인 감염이 될 수 있는 CxFV는 초기 단계에서 WNV 복제를 억제할 수 있다8. 또 다른 곤충 특이적 플라비바이러스인 세포융합제 바이러스(cell-fusing agent virus, CFAV)는 이집트숲모기에서 DENV와 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)의 번식을 억제하는 것으로 밝혀졌다9. 따라서 이 프로토콜은 모기 관련 바이러스를 분리하는 데 유용한 접근 방식이며 모기와 관련된 병원체의 분포 및 모기 매개 질병의 통제에 대한 추가 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 목적은 다양한 세포주를 사용하여 모기 관련 바이러스를 분리하는 실용적인 방법을 제공하는 것이었습니다. 박테리아나 곰팡이에 의한 오염을 피하기 위해 모기 균질액의 상층액에 항생제-항진균제(페니실린-스트렙토마이신-암포테리신)를 첨가하는 것이 중요합니다. 현장에서 얻은 모기와 바이러스 상층액은 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 냉장 보관해야 합니다.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
