פיצול הידרוג'לים בתפזורת ועיבוד להידרוג'לים גרעיניים ליישומים ביו-רפואיים
Summary
עבודה זו מתארת שיטות פשוטות, ניתנות להתאמה ובעלות נמוכה לייצור מיקרוג’לים עם פיצול שחול, לעבד את המיקרוג’לים להידרוג’לים גרגיריים הניתנים להזרקה, וליישם את ההידרוג’לים הגרעיניים כדיו להדפסת שחול עבור יישומים ביו-רפואיים.
Abstract
הידרוג’לים גרעיניים הם מכלולים תקועים של מיקרו-חלקיקי הידרוג’ל (כלומר, “מיקרוג’לים”). בתחום הביו-חומרים, להידרוג’לים גרגיריים יש תכונות יתרון רבות, כולל יכולת הזרקה, נקבוביות בקנה מידה זעיר ויכולת כוונון על ידי ערבוב אוכלוסיות מיקרוג’ל מרובות. שיטות לייצור מיקרוג’לים מסתמכות לעתים קרובות על תחליבי מים בשמן (למשל, מיקרופלואידיקה, תחליב אצווה, אלקטרוספרייינג) או פוטוליתוגרפיה, אשר עשויים להציג דרישות גבוהות במונחים של משאבים ועלויות, וייתכן שאינם תואמים להידרוג’לים רבים. עבודה זו מפרטת שיטות פשוטות אך יעילות ביותר לייצור מיקרו-ג’לים באמצעות פיצול שחול ולעיבודם להידרוג’לים גרעיניים שימושיים ליישומים ביו-רפואיים (למשל, דיו להדפסה בתלת-ממד). ראשית, הידרוג’לים בתפזורת (תוך שימוש בחומצה היאלורונית ניתנת לפוטו-קרוסלינק (HA) כדוגמה) מובלטים באמצעות סדרה של מחטים בקטרים קטנים יותר ברצף כדי ליצור מיקרוג’לים מקוטעים. טכניקת ייצור מיקרו-ג’ל זו היא מהירה, בעלות נמוכה וניתנת להרחבה רבה. מתוארות שיטות לחסימת מיקרוג’לים להידרוג’לים גרגיריים על ידי צנטריפוגה וסינון מונחה ואקום, עם קישור פוסט-קרוסלינקינג אופציונלי לייצוב הידרוג’ל. לבסוף, הידרוג’לים גרגיריים המיוצרים ממיקרוג’לים מקוטעים מודגמים כדיו להדפסת שחול. בעוד שהדוגמאות המתוארות כאן משתמשות ב- HA הניתן לניתוק פוטו-קרוסלינק להדפסה תלת-ממדית, השיטות ניתנות להתאמה בקלות למגוון רחב של סוגי הידרוג’ל ויישומים ביו-רפואיים.
Introduction
הידרוג’לים גרעיניים מיוצרים באמצעות אריזה של חלקיקי הידרוג’ל (כלומר, מיקרוג’לים) והם סוג מרגש של ביו-חומרים עם תכונות יתרון רבות ליישומים ביו-רפואיים 1,2,3. בשל המבנה החלקיקי שלהם, הידרוג’לים גרגיריים מדללים גזירה ומרפאים את עצמם, ומאפשרים את השימוש בהם כדיו בהדפסת שחול (ביו), תמיכות גרגיריות להדפסה משובצת וטיפולים הניתנים להזרקה 4,5,6,7,8,9. בנוסף, החלל הריק בין מיקרוגלים מספק נקבוביות בקנה מידה זעיר לתנועת תאים ודיפוזיה מולקולרית 8,10,11. יתר על כן, ניתן לשלב אוכלוסיות מיקרו-ג’ל מרובות לפורמולציה אחת כדי לאפשר כוונון משופר ופונקציונליות חומרית 8,10,12,13. תכונות חשובות אלה הניעו את ההתרחבות המהירה של פיתוח הידרוג’ל גרגירי בשנים האחרונות.
יש מגוון של שיטות זמינות ליצירת מיקרוג’לים לקראת ייצור הידרוג’ל גרעיני, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלו. לדוגמה, מיקרוג’לים נוצרים לעתים קרובות מתחלי מים בשמן באמצעות מיקרופלואידיקה של טיפות 4,11,13,14,15,16,17, תחליב אצווה 7,18,19,20,21,22, או אלקטרוספרייינג 6,23, 24,25. שיטות אלה מניבות מיקרוג’לים כדוריים בקטרים אחידים (מיקרופלואידיים) או פולידיספראז (תחליבי אצווה, אלקטרוספרייינג). ישנן כמה מגבלות לשיטות ייצור תחליב מים בשמן אלה, כולל ייצור פוטנציאלי בתפוקה נמוכה, הצורך בפתרונות מבשרי הידרוג’ל בצמיגות נמוכה, והעלות והמשאבים הגבוהים להתקנה. בנוסף, פרוטוקולים אלה עשויים לדרוש שמנים וחומרים פעילי שטח קשים שיש לשטוף מהמיקרוגלים באמצעות נהלים המוסיפים שלבי עיבוד, וייתכן שיהיה קשה לתרגם אותם לתנאים סטריליים ליישומים ביו-רפואיים במעבדות רבות. הסרת הצורך בתחליב מים בשמן, ניתן להשתמש גם בליתוגרפיה (צילום), שבה תבניות או מסכות צילום משמשות לשליטה בריפוי של מיקרוג’לים מתמיסות מבשרי הידרוג’ל 1,26,27. בדומה למיקרופלואידיקה, שיטות אלה עשויות להיות מוגבלות בתפוקת הייצור שלהן, וזהו אתגר גדול כאשר יש צורך בכמויות גדולות.
כחלופה לשיטות אלה, פיצול מכני של הידרוג’לים בתפזורת שימש לייצור מיקרוג’לים בגדלים לא סדירים 19,28,29,30,31,32. לדוגמה, הידרוג’לים בתפזורת יכולים להיווצר מראש ולאחר מכן לעבור דרך רשתות או מסננות כדי ליצור מיקרוג’לים מקוטעים, תהליך שאף נעשה בנוכחות תאים בתוך גדילי מיקרוג’ל33,34. הידרוג’לים בתפזורת עובדו גם הם למיקרוג’לים עם הפרעה מכנית באמצעות טכניקות כגון השחזה עם טיט ומזיק או באמצעות שימוש בבלנדרים מסחריים 35,36,37. אחרים גם השתמשו בתסיסה מכנית במהלך היווצרות הידרוג’ל כדי לייצר מיקרוג’לים מקוטעים (כלומר, ג’לים נוזליים)31.
השיטות כאן מרחיבות את טכניקות הפיצול המכני הללו ומציגות גישה פשוטה לייצור מיקרוג’לים עם פיצול שחול, תוך שימוש בהידרוג’לים של חומצה היאלורונית (HA) הניתנת לפוטו-קרוסלינקינג כדוגמה. פיצול שחול משתמש רק במזרקים ובמחטים כדי לייצר מיקרוג’לים מקוטעים בשיטה זולה, בעלת תפוקה גבוהה וקלה להרחבה המתאימה למגוון רחב של הידרוג’לים19,32. יתר על כן, שיטות להרכבת מיקרוג’לים מקוטעים אלה להידרוג’לים גרעיניים מתוארות באמצעות צנטריפוגה (אריזה נמוכה) או סינון מונחה ואקום (אריזה גבוהה). לבסוף, היישום של הידרוג’לים גרגיריים מקוטעים אלה נדון לשימוש כדיו להדפסת שחול. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטות פשוטות הניתנות להתאמה למגוון רחב של הידרוג’לים וניתן ליישם אותן כמעט בכל מעבדה המעוניינת בהידרוג’לים גרעיניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מתוארות שיטות לייצור הידרוג’לים גרעיניים באמצעות מיקרוג’לים מקוטעים של שחול ואריזה על ידי צנטריפוגה או סינון מונחה ואקום. בהשוואה לשיטות אחרות לייצור מיקרוג’ל (כלומר, מיקרופלואידיקה, תחליב אצווה, אלקטרוספרייינג, פוטוליתוגרפיה), ייצור מיקרו-ג’ל של פיצול שחול הוא מהיר מאוד, בעלות נמוכה, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות תוכנית MRSEC של UPenn (DMR-1720530) ומלגות מחקר לתארים מתקדמים (ל- V.G.M ו- M.E.P.) והמכונים הלאומיים לבריאות (R01AR077362 עד J.A.B.).
Materials
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
