Fragmenteren van bulkhydrogels en verwerking tot granulaire hydrogels voor biomedische toepassingen
Summary
Dit werk beschrijft eenvoudige, aanpasbare en goedkope methoden om microgels met extrusiefragmentatie te fabriceren, de microgels te verwerken tot injecteerbare granulaire hydrogels en de granulaire hydrogels toe te passen als extrusiedrukinkten voor biomedische toepassingen.
Abstract
Granulaire hydrogels zijn vastgelopen samenstellingen van hydrogelmicrodeeltjes (d.w.z. “microgels”). Op het gebied van biomaterialen hebben granulaire hydrogels veel voordelige eigenschappen, waaronder injecteerbaarheid, porositeit op microschaal en tonijnbaarheid door meerdere microgelpopulaties te mengen. Methoden om microgels te fabriceren zijn vaak afhankelijk van water-in-olie-emulsies (bijv. Microfluïdica, batch-emulsies, elektrospraying) of fotolithografie, die hoge eisen kunnen stellen aan middelen en kosten, en mogelijk niet compatibel zijn met veel hydrogels. Dit werk beschrijft eenvoudige maar zeer effectieve methoden om microgels te fabriceren met behulp van extrusiefragmentatie en om ze te verwerken tot granulaire hydrogels die nuttig zijn voor biomedische toepassingen (bijv. 3D-printinkten). Ten eerste worden bulkhydrogels (met fotocrosslinkbaar hyaluronzuur (HA) als voorbeeld) geëxtrudeerd door een reeks naalden met sequentieel kleinere diameters om gefragmenteerde microgels te vormen. Deze microgelfabricagetechniek is snel, goedkoop en zeer schaalbaar. Methoden om microgels in granulaire hydrogels te jammen door centrifugatie en vacuümgestuurde filtratie worden beschreven, met optionele post-crosslinking voor hydrogelstabilisatie. Ten slotte worden granulaire hydrogels vervaardigd uit gefragmenteerde microgels gedemonstreerd als extrusiedrukinkten. Hoewel de hierin beschreven voorbeelden fotocrosslinkbare HA gebruiken voor 3D-printen, zijn de methoden gemakkelijk aan te passen voor een breed scala aan hydrogeltypen en biomedische toepassingen.
Introduction
Granulaire hydrogels worden vervaardigd door het verpakken van hydrogeldeeltjes (d.w.z. microgels) en zijn een opwindende klasse van biomaterialen met veel voordelige eigenschappen voor biomedische toepassingen 1,2,3. Vanwege hun deeltjesstructuur zijn granulaire hydrogels afschuifverdunnend en zelfherstellend, waardoor ze kunnen worden gebruikt als extrusiedruk (bio)inkten, granulaire ondersteuningen voor ingebed printen en injecteerbare therapieën 4,5,6,7,8,9. Bovendien biedt de lege ruimte tussen microgels een porositeit op microschaal voor celbeweging en moleculaire diffusie 8,10,11. Verder kunnen meerdere microgelpopulaties worden gecombineerd tot één formulering om een verbeterde tonijnbaarheid en materiaalfunctionaliteit mogelijk te maken 8,10,12,13. Deze belangrijke eigenschappen hebben de snelle uitbreiding van de ontwikkeling van granulaire hydrogel in de afgelopen jaren gemotiveerd.
Er is een scala aan methoden beschikbaar om microgels te vormen voor granulaire hydrogelfabricage, elk met zijn eigen voor- en nadelen. Microgels worden bijvoorbeeld vaak gevormd uit water-in-olie-emulsies met behulp van druppelmicrofluïdica 4,11,13,14,15,16,17, batch-emulsies 7,18,19,20,21,22, of elektrospraying 6,23, 24,25. Deze methoden leveren bolvormige microgels op met uniforme (microfluïdica) of polydisperse (batch-emulsies, elektrospraying) diameters. Er zijn enkele beperkingen aan deze water-in-olie emulsie fabricagemethoden, waaronder potentieel lage doorvoerproductie, de behoefte aan hydrogel-precursoroplossingen met een lage viscositeit en de hoge kosten en middelen voor installatie. Bovendien kunnen deze protocollen agressieve oliën en oppervlakteactieve stoffen vereisen die uit de microgels moeten worden gewassen met behulp van procedures die verwerkingsstappen toevoegen, en kunnen ze moeilijk te vertalen zijn naar steriele omstandigheden voor biomedische toepassingen in veel laboratoria. Om de noodzaak van water-in-olie-emulsies weg te nemen, kan ook (foto)lithografie worden gebruikt, waarbij mallen of fotomaskers worden gebruikt om het uitharden van microgels uit hydrogel precursoroplossingen te beheersen 1,26,27. Net als microfluïdica kunnen deze methoden beperkt zijn in hun productiedoorvoer, wat een grote uitdaging is wanneer grote volumes nodig zijn.
Als alternatief voor deze methoden is mechanische fragmentatie van bulkhydrogels gebruikt om microgels te fabriceren met onregelmatige maten 19,28,29,30,31,32. Bulkhydrogels kunnen bijvoorbeeld worden voorgevormd en vervolgens door mazen of zeven worden geleid om gefragmenteerde microgels te vormen, een proces dat zelfs is uitgevoerd in aanwezigheid van cellen in microgelstrengen33,34. Bulkhydrogels zijn ook verwerkt tot microgels met mechanische verstoring met behulp van technieken zoals malen met vijzel en stamper of door het gebruik van commerciële blenders 35,36,37. Anderen hebben ook mechanische agitatie tijdens hydrogelvorming gebruikt om gefragmenteerde microgels (d.w.z. vloeistofgels) te fabriceren31.
De methoden hierin breiden deze mechanische fragmentatietechnieken uit en presenteren een eenvoudige benadering om microgels met extrusiefragmentatie te fabriceren, met behulp van fotocrosslinkable hyaluronzuur (HA) hydrogels als voorbeeld. Extrusiefragmentatie gebruikt alleen spuiten en naalden om gefragmenteerde microgels te fabriceren in een goedkope, hoge doorvoer en gemakkelijk schaalbare methode die geschikt is voor een breed scala aan hydrogels19,32. Verder worden methoden om deze gefragmenteerde microgels in korrelige hydrogels te assembleren beschreven met behulp van centrifugatie (lage verpakking) of vacuümgestuurde filtratie (hoge verpakking). Ten slotte wordt de toepassing van deze gefragmenteerde granulaire hydrogels besproken voor gebruik als extrusiedrukinkt. Het doel van dit protocol is om eenvoudige methoden te introduceren die kunnen worden aangepast aan een breed scala aan hydrogels en kunnen worden geïmplementeerd in vrijwel elk laboratorium dat geïnteresseerd is in granulaire hydrogels.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin worden methoden beschreven om granulaire hydrogels te fabriceren met behulp van extrusie gefragmenteerde microgels en verpakking door centrifugatie of vacuümgestuurde filtratie. In vergelijking met andere microgelfabricagemethoden (d.w.z. microfluïdica, batch-emulsies, elektrospraying, fotolithografie), is de fabricage van extrusiefragmentatiemicrogel zeer snel, goedkoop, gemakkelijk schaalbaar en vatbaar voor een breed scala aan hydrogelsystemen. Verder is dit protocol zeer herhaalbaar met minimale batch-to-bat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation via het UPenn MRSEC-programma (DMR-1720530) en graduate research fellowships (aan V.G.M en M.E.P.) en de National Institutes of Health (R01AR077362 aan J.A.B.).
Materials
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1 (November 2020), 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S. et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), eabk3087 (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H. et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S. et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A. et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192 (September 2018), 560-568 (2019).
- Griffin, D. R. et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q. et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232 (December 2019), 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F. et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A. et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H. et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L. et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3) 035004 (2013).
- Gehlen, D. B. et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C. et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R. et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H. et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A. et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B. et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J. et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N. et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G. et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. In Press (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N. et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, e00069 (2019).
- Skardal, A. et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 110, 53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 131, 56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3 (November 2017), 49-61 (2018).
- Ding, A. et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), e2109394 (2022).
