تجزئة المواد الهلامية السائبة ومعالجتها إلى هيدروجيل حبيبي للتطبيقات الطبية الحيوية
Summary
يصف هذا العمل طرقا مباشرة وقابلة للتكيف ومنخفضة التكلفة لتصنيع الهلاميات الدقيقة مع تجزئة البثق ، ومعالجة الهلاميات الدقيقة في هيدروجيل حبيبي قابل للحقن ، وتطبيق الهلاميات المائية الحبيبية كأحبار طباعة البثق للتطبيقات الطبية الحيوية.
Abstract
الهلاميات المائية الحبيبية هي مجموعات محشورة من جزيئات الهيدروجيل الدقيقة (أي “microgels”). في مجال المواد الحيوية ، تتمتع الهلاميات المائية الحبيبية بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك الحقن ، والمسامية الدقيقة ، والقابلية عن طريق خلط مجموعات ميكروجيل متعددة. غالبا ما تعتمد طرق تصنيع الهلام الدقيق على مستحلبات الماء في الزيت (على سبيل المثال ، الموائع الدقيقة ، مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي) أو الطباعة الحجرية الضوئية ، والتي قد تمثل متطلبات عالية من حيث الموارد والتكاليف ، وقد لا تكون متوافقة مع العديد من الهلاميات المائية. يفصل هذا العمل طرقا بسيطة ولكنها فعالة للغاية لتصنيع microgels باستخدام تجزئة البثق ومعالجتها في هيدروجيل حبيبي مفيد للتطبيقات الطبية الحيوية (على سبيل المثال ، أحبار الطباعة 3D). أولا ، يتم بثق الهيدروجيلات السائبة (باستخدام حمض الهيالورونيك القابل للربط الضوئي (HA) كمثال) من خلال سلسلة من الإبر ذات الأقطار الأصغر بالتتابع لتشكيل microgels مجزأة. تقنية تصنيع microgel هذه سريعة ومنخفضة التكلفة وقابلة للتطوير بدرجة كبيرة. يتم وصف طرق التشويش على المواد الهلامية الدقيقة في الهلاميات المائية الحبيبية عن طريق الطرد المركزي والترشيح المدفوع بالتفريغ ، مع ربط اختياري لاحق لتثبيت الهيدروجيل. وأخيرا ، يتم عرض الهلاميات المائية الحبيبية المصنعة من الهلاميات الدقيقة المجزأة كأحبار طباعة بثق. في حين أن الأمثلة الموضحة هنا تستخدم HA القابلة للربط الضوئي للطباعة 3D ، فإن الطرق قابلة للتكيف بسهولة مع مجموعة واسعة من أنواع الهيدروجيل والتطبيقات الطبية الحيوية.
Introduction
يتم تصنيع الهيدروجيل الحبيبي من خلال تعبئة جزيئات الهيدروجيل (أي الهلاميات الدقيقة) وهي فئة مثيرة من المواد الحيوية مع العديد من الخصائص المفيدة للتطبيقات الطبية الحيوية1،2،3. نظرا لبنيتها الجسيمية ، فإن الهلاميات المائية الحبيبية ترقق القص والشفاء الذاتي ، مما يسمح باستخدامها كأحبار طباعة البثق (الحيوية) ، والدعامات الحبيبية للطباعة المضمنة ، والعلاجات القابلة للحقن4،5،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مساحة الفراغ بين microgels مسامية ميكروسكيل لحركة الخلايا والانتشار الجزيئي8،10،11. علاوة على ذلك ، يمكن دمج مجموعات microgel متعددة في تركيبة واحدة للسماح بتحسين القدرة على الضبط ووظائف المواد8،10،12،13. وقد حفزت هذه الخصائص الهامة التوسع السريع لتطوير هيدروجيل الحبيبات في السنوات الأخيرة.
هناك مجموعة من الطرق المتاحة لتشكيل microgels نحو تصنيع هيدروجيل حبيبي ، لكل منها مزاياها وعيوبها. على سبيل المثال ، غالبا ما تتشكل الهلاميات الدقيقة من مستحلبات الماء في الزيت باستخدام الموائع الدقيقة القطيرات4،11،13،14،15،16،17 ، مستحلبات الدفعات7،18،19،20،21،22 ، أو الرش الكهربائي6،23 ، 24,25. تنتج هذه الطرق هلاميات كروية ذات أقطار موحدة (الموائع الدقيقة) أو polydisperse (مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي). هناك بعض القيود على طرق تصنيع مستحلب الماء في الزيت هذه ، بما في ذلك الإنتاج المنخفض الإنتاجية المحتمل ، والحاجة إلى حلول سلائف هيدروجيل منخفضة اللزوجة ، وارتفاع التكلفة والموارد اللازمة للإعداد. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب هذه البروتوكولات زيوتا قاسية وخافضات للتوتر السطحي يجب غسلها من الهلاميات الدقيقة باستخدام إجراءات تضيف خطوات معالجة ، وقد يكون من الصعب ترجمتها إلى ظروف معقمة للتطبيقات الطبية الحيوية في العديد من المختبرات. إزالة الحاجة إلى مستحلبات الماء في الزيت ، يمكن أيضا استخدام الطباعة الحجرية (الصورة) ، حيث يتم استخدام القوالب أو الأقنعة الضوئية للتحكم في علاج microgels من حلول سلائف الهيدروجيل1،26،27. مثل الموائع الدقيقة ، قد تكون هذه الطرق محدودة في إنتاجية إنتاجها ، وهو تحد كبير عندما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة.
كبديل لهذه الطرق ، تم استخدام التجزئة الميكانيكية للهيدروجيل السائب لتصنيع microgels بأحجام غير منتظمة19،28،29،30،31،32. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل الهيدروجيل السائب مسبقا وتمريره لاحقا عبر الشبكات أو المناخل لتشكيل microgels مجزأة ، وهي عملية تم إجراؤها حتى في وجود خلايا داخل خيوط microgel33,34. كما تمت معالجة المواد الهلامية المائية السائبة إلى مواد هلامية دقيقة مع اضطراب ميكانيكي باستخدام تقنيات مثل الطحن باستخدام الملاط والمدقة أو من خلال استخدام الخلاطات التجارية35،36،37. كما استخدم آخرون التحريض الميكانيكي أثناء تكوين الهيدروجيل لتصنيع المواد الهلامية الدقيقة المجزأة (أي المواد الهلامية السائلة)31.
تتوسع الطرق الواردة هنا في تقنيات التجزئة الميكانيكية هذه وتقدم نهجا بسيطا لتصنيع المواد الهلامية الدقيقة مع تجزئة البثق ، باستخدام هيدروجيل حمض الهيالورونيك القابل للربط الضوئي (HA) كمثال. يستخدم تجزئة البثق المحاقن والإبر فقط لتصنيع microgels مجزأة بطريقة منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية وقابلة للتطوير بسهولة ومناسبة لمجموعة واسعة من الهيدروجيل19,32. علاوة على ذلك ، يتم وصف طرق تجميع هذه الهلاميات الدقيقة المجزأة في هيدروجيل حبيبي إما باستخدام الطرد المركزي (التعبئة المنخفضة) أو الترشيح المدفوع بالفراغ (التعبئة العالية). أخيرا ، تتم مناقشة تطبيق هذه المواد الهلامية المائية الحبيبية المجزأة لاستخدامها كحبر طباعة بثق. الهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طرق بسيطة قابلة للتكيف مع مجموعة واسعة من الهيدروجيل ويمكن تنفيذها في أي مختبر تقريبا مهتم بالهلاميات المائية الحبيبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف طرق تصنيع الهيدروجيل الحبيبي باستخدام الهلاميات الدقيقة المجزأة البثق والتعبئة إما عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح المدفوع بالفراغ. بالمقارنة مع طرق تصنيع microgel الأخرى (أي الموائع الدقيقة ، مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي ، الطباعة الحجرية الضوئية) ، فإن تصنيع microgel لتجزئ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم من خلال برنامج UPenn MRSEC (DMR-1720530) وزمالات أبحاث الدراسات العليا (إلى V.G.M و M.E.P.) والمعاهد الوطنية للصحة (R01AR077362 إلى J.A.B).
Materials
| 15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 30 G NT Premium Series Dispensing Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) | Fisher Scientific | 14-823-435 | Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX). |
| Black folders | Various Vendors | ||
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") | Grainger | 5FVH5 | Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available. |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") | Grainger | 5FVJ3 | |
| Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") | Grainger | 5FVL0 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 14190-250 | Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles. |
| Durapore Membrane Filter, 0.22 µm | Millipore | GVWP04700 | |
| Epifluorescent or confocal microscope | Various Vendors | To visualize microgels and granular hydrogels | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Extrusion printer | Custom-built | Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX. | |
| Filter Adapters | Fisher Scientific | 05-888-107 | Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX). |
| Filter Flask | Various Vendors | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) | Sigma-Aldrich | 52471 | |
| Glass microscope slide | Various Vendors | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html | |
| Laptop | Various Vendors | ||
| Luer-Lock Tip Caps | Integrated Dispensin g Solutions | 9991329 | |
| Metal spatula for scooping | Various Vendors | ||
| Microcentrifuge | Various Vendors | Capable of speed up to 18,000 x g | |
| Microscoft Execl | Microsoft | Other programs can be used, such as Google Slides. | |
| OmniCure S2000 Spot UV Curing System | Excelitas Technologies | S2000 | Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired. |
| Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate | Fisher Scientific | FB966C | Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available. |
| Radiometer | Various Vendors | ||
| Repetier Host | Hot-World GmbH & Co. KG | 3D printing software | |
| Screw-based extrusion printer | Various Vendors | This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available. | |
| Solidworks/CAD software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD. | |
| Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line | Various Vendors | ||
| UV Eye Protection (i.e., safety glasses) | Various Vendors |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
- Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
- Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
- Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
- Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
- Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
- Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
- Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
- Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
- Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
- Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
- Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
- Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
- Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
- Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
- Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
- Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
- Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
- Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
- Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
- Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
- Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
- Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
- Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
- Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
