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Abstract
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Bioengineering

대량 하이드로젤을 단편화하고 생물 의학 응용 분야를 위한 입상 하이드로젤로 처리

Published: May 17, 2022
doi:
10.3791/63867
, ,
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences,University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute,University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Colorado Boulder

Summary

이 작업은 압출 단편화로 마이크로 젤을 제조하고, 마이크로 젤을 주사용 과립 하이드로 젤로 처리하고, 과립 하이드로젤을 생물 의학 응용 분야를위한 압출 인쇄 잉크로 적용하는 간단하고 적응력이 뛰어나며 저렴한 방법을 설명합니다.

Abstract

과립형 하이드로겔은 하이드로겔 마이크로입자(즉, “마이크로겔”)의 막힌 어셈블리이다. 생체 재료 분야에서, 과립형 하이드로겔은 주사성, 마이크로스케일 다공성, 및 다수의 마이크로겔 집단을 혼합함으로써 튜닝성을 포함하는 많은 유리한 특성을 갖는다. 마이크로겔을 제조하는 방법은 종종 유중수 에멀젼(예를 들어, 마이크로유체학, 배치 에멀젼, 전기 분무) 또는 포토리소그래피에 의존하는데, 이는 자원 및 비용 측면에서 높은 요구를 제시할 수 있고, 많은 하이드로겔과 양립할 수 없을 수 있다. 이 작업은 압출 단편화를 사용하여 마이크로 젤을 제조하고 생물 의학 응용 분야 (예 : 3D 인쇄 잉크)에 유용한 과립 하이드로 젤로 처리하는 간단하면서도 매우 효과적인 방법을 자세히 설명합니다. 먼저, 벌크 하이드로젤(일례로 광가교성 히알루론산(HA)을 사용)은 순차적으로 더 작은 직경의 일련의 바늘을 통해 압출되어 단편화된 마이크로겔을 형성한다. 이 마이크로 겔 제조 기술은 빠르고 저렴하며 확장성이 뛰어납니다. 원심분리 및 진공 구동 여과에 의해 마이크로겔을 과립형 하이드로겔로 잼하는 방법이 설명되며, 하이드로겔 안정화를 위한 선택적인 사후 가교결합이 기재되어 있다. 마지막으로, 단편화 된 마이크로 겔로 제조 된 과립 하이드로 젤은 압출 인쇄 잉크로 입증됩니다. 본원에 기재된 실시예가 3D 프린팅을 위해 광가교가능한 HA를 사용하는 반면, 상기 방법은 매우 다양한 하이드로겔 유형 및 생물의학적 응용에 쉽게 적응할 수 있다.

Introduction

과립형 하이드로겔은 하이드로겔 입자(즉, 마이크로겔)의 패킹을 통해 제조되며, 생물의학 응용1,2,3에 많은 유리한 특성을 갖는 흥미로운 종류의 생체재료이다. 미립자 구조로 인해 과립 형 하이드로 젤은 전단 얇아지고 자가 치유되어 압출 인쇄 (바이오) 잉크, 임베디드 인쇄를위한 세분화 된 지지대 및 주사 가능한 치료제 4,5,6,7,8,9로 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 마이크로겔 사이의 공극 공간은 세포 이동 및 분자 확산8,10,11을 위한 마이크로스케일 다공도를 제공한다. 또한, 다수의 마이크로겔 집단이 단일 제형으로 조합될 수 있어서, 향상된 튜닝성 및 물질 기능성(8,10,12,13)을 허용한다. 이러한 중요한 특성은 최근 몇 년 동안 과립 하이드로겔 개발의 급속한 확장을 촉진했습니다.

과립 하이드로겔 제조를 위해 마이크로겔을 형성하기 위해 이용 가능한 다양한 방법이 있으며, 각각은 그 자체의 장점과 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 마이크로겔은 종종 액적 마이크로유체학 4,11,13,14,15,16,17, 배치 에멀젼 7,18,19,20,21,22, 또는 전기 분 무 6,23을 사용하는 유중수 에멀젼으로부터 형성되고, 24,25. 이러한 방법은 균일 한 (마이크로 유체학) 또는 다분산 (배치 에멀젼, 전기 분무) 직경의 구형 마이크로 젤을 산출합니다. 이러한 유중수 에멀젼 제조 방법에는 잠재적으로 낮은 처리량 생산, 저점도 하이드로겔 전구체 솔루션의 필요성, 설치를위한 높은 비용 및 자원을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 추가적으로, 이들 프로토콜은 가공 단계를 추가하는 절차를 사용하여 마이크로겔로부터 세척되어야 하는 가혹한 오일 및 계면활성제를 필요로 할 수 있고, 많은 실험실에서 생물 의학 응용을 위한 멸균 상태로 변환하기 어려울 수 있다. 유중수 에멀젼의 필요성을 제거하고, (사진) 리소그래피를 사용할 수도 있으며, 여기서 몰드 또는 포토 마스크는 하이드로겔 전구체 용액 1,26,27로부터 마이크로겔의 경화를 제어하기 위해 사용된다. 미세 유체 공학과 마찬가지로 이러한 방법은 생산 처리량이 제한 될 수 있으며 이는 대량이 필요할 때 주요 과제입니다.

이들 방법의 대안으로서, 벌크 하이드로겔의 기계적 단편화는 불규칙한 크기가 19,28,29,30,31,32인 마이크로겔을 제조하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 벌크 하이드로겔은 미리 형성되고 후속적으로 메쉬 또는 체를 통과하여 단편화된 마이크로겔을 형성할 수 있으며, 이 과정은 마이크로겔 가닥(33,34) 내의 세포의 존재 하에서도 이루어졌다. 벌크 하이드로젤은 또한 모르타르 및 페슬로 분쇄하거나 상업용 블렌더35,36,37의 사용을 통해 분쇄와 같은 기술을 사용하여 기계적 파괴가있는 마이크로 겔로 가공되었습니다. 다른 것들은 또한 단편화된 마이크로겔(즉, 유체 겔)31을 제조하기 위해 하이드로겔 형성 동안 기계적 교반을 이용하였다.

본 명세서의 방법은 이러한 기계적 단편화 기술을 확장하고, 예를 들어 광가교성 히알루론산(HA) 하이드로젤을 사용하여 압출 단편화와 함께 마이크로겔을 제조하는 간단한 접근법을 제시한다. 압출 단편화는 주사기와 바늘만을 사용하여 광범위한 하이드로젤19,32에 적합한 저비용, 높은 처리량 및 쉽게 확장 가능한 방법으로 단편화된 마이크로겔을 제조한다. 또한, 이들 단편화된 마이크로겔을 과립형 하이드로겔로 조립하는 방법은 원심분리(low packing) 또는 진공 구동 여과(하이패킹)를 사용하여 기술된다. 마지막으로, 이들 단편화된 과립형 하이드로겔의 적용은 압출 인쇄 잉크로서 사용하기 위해 논의된다. 이 프로토콜의 목표는 다양한 하이드로젤에 적응할 수 있고 과립형 하이드로젤에 관심이 있는 거의 모든 실험실에서 구현할 수 있는 간단한 방법을 도입하는 것입니다.

Protocol

1. 광가교를 사용하여 주사기 내부에 벌크 하이드로젤 제조 참고: 광가교를 사용하는 주사기 내부의 벌크 하이드로겔 제작에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 노보넨 변형 히알루론산(NorHA)을 사용하여 광매개 티올-엔 반응을 사용하여 벌크 하이드로젤을 제작합니다. NorHA의 합성을 위한 상세한 절차는 다른 곳에서 설명된?…

Representative Results

이러한 프로토콜의 대표적인 결과는 도 3 및 도 6에 도시되어 있다. 압출 단편화는 직경이 10-300 μm 범위인 들쭉날쭉한 다각형 모양의 마이크로젤을 생성합니다(그림 3). 또한 원형도는 0.2 (원형이 아님)에서 거의 1 (완벽한 원)까지이며 종횡비는 1-3 (그림 3)입니다. 이러한 파라미터는 단편화 과정에 의해 형성?…

Discussion

본원에는, 압출 단편화된 마이크로겔을 사용하여 과립형 하이드로겔을 제조하고 원심분리 또는 진공 구동 여과에 의해 패킹하는 방법이 기재되어 있다. 다른 마이크로겔 제조 방법(즉, 마이크로유체학, 배치 에멀젼, 전기 분무, 포토리소그래피)과 비교하여, 압출 단편화 마이크로겔 제조는 매우 빠르고, 저비용이며, 쉽게 확장가능하며, 매우 다양한 하이드로겔 시스템에 순응할 수 있다. 또한, 이 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 UPenn MRSEC 프로그램 (DMR-1720530)과 대학원 연구 펠로우십 (V.G.M 및 M.E.P.) 및 국립 보건원 (R01AR077362 ~ J.A.B.)을 통해 국립 과학 재단의 지원을 받았습니다.

Materials

15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube Corning 430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) Fisher Scientific 14-823-435 Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") Grainger 5FVH5 Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") Grainger 5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") Grainger 5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 14190-250 Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm Millipore GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope Various Vendors To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Extrusion printer Custom-built Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters Fisher Scientific 05-888-107 Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) Sigma-Aldrich 52471
Glass microscope slide Various Vendors
ImageJ National Institutes of Health "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps Integrated Dispensin g Solutions 9991329
Metal spatula for scooping Various Vendors
Microcentrifuge Various Vendors Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl Microsoft Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System Excelitas Technologies S2000 Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate Fisher Scientific FB966C Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer Various Vendors
Repetier Host Hot-World GmbH & Co. KG 3D printing software
Screw-based extrusion printer Various Vendors This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software Dassault Systèmes SolidWorks Corporation Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses) Various Vendors
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References

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  9. Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  11. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
  14. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
  28. Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  30. Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
  32. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
  34. Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
  45. Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
  48. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).

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Muir, V. G., Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (183), e63867, doi:10.3791/63867 (2022).
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