JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Fragmentering av bulkhydrgeler og prosessering i granulære hydrogeler for biomedisinske applikasjoner

Published: May 17, 2022
doi:
10.3791/63867
Victoria G. Muir1, Margaret E. Prendergast1, Jason A. Burdick1,2,3
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences,University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute,University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Colorado Boulder

Summary

Dette arbeidet beskriver enkle, tilpasningsdyktige og rimelige metoder for å fremstille mikrogeler med ekstruderingsfragmentering, behandle mikrogelene i injiserbare granulære hydrogeler, og bruke granulære hydrogeler som ekstruderingstrykkfarger for biomedisinske applikasjoner.

Abstract

Granulære hydrogeler er fastkjørte samlinger av hydrogelmikropartikler (dvs. “mikrogeler”). Innen biomaterialer har granulære hydrogeler mange fordelaktige egenskaper, inkludert injiserbarhet, mikroskala porøsitet og tunabilitet ved å blande flere mikrogelpopulasjoner. Metoder for å fremstille mikrogeler er ofte avhengige av vann-i-olje-emulsjoner (f.eks. mikrofluidikk, batchemulsjoner, elektrospraying) eller fotolitografi, som kan utgjøre høye krav når det gjelder ressurser og kostnader, og kan ikke være kompatible med mange hydrogeler. Dette arbeidet beskriver enkle, men svært effektive metoder for å fremstille mikrogeler ved hjelp av ekstruderingsfragmentering og for å behandle dem i granulære hydrogeler som er nyttige for biomedisinske applikasjoner (f.eks. 3D-trykkfarger). For det første ekstruderes bulkhydrgeler (ved hjelp av fotocrosslinkable hyaluronsyre (HA) som et eksempel) gjennom en rekke nåler med sekvensielt mindre diametre for å danne fragmenterte mikrogeler. Denne mikrogel fabrikasjonsteknikken er rask, rimelig og svært skalerbar. Metoder for å jamme mikrogeler i granulære hydrogeler ved sentrifugering og vakuumdrevet filtrering er beskrevet, med valgfri post-crosslinking for hydrogelstabilisering. Til slutt er granulære hydrogeler fremstilt av fragmenterte mikrogeler demonstrert som ekstruderingstrykkfarger. Mens eksemplene som er beskrevet her, bruker fotocrosslinkable HA for 3D-utskrift, er metodene lett tilpasningsdyktige for et bredt utvalg av hydrogeltyper og biomedisinske applikasjoner.

Introduction

Granulære hydrogeler fremstilles gjennom pakking av hydrogelpartikler (dvs. mikrogeler) og er en spennende klasse biomaterialer med mange fordelaktige egenskaper for biomedisinske applikasjoner 1,2,3. På grunn av deres partikkelstruktur er granulære hydrogeler skjærfortynnende og selvhelbredende, noe som gjør det mulig å bruke dem som ekstruderingstrykk (bio)blekk, granulære støtter for innebygd utskrift og injiserbare terapeutiske behandlinger 4,5,6,7,8,9. I tillegg gir det tomme rommet mellom mikrogeler en mikroskala porøsitet for cellebevegelse og molekylær diffusjon 8,10,11. Videre kan flere mikrogelpopulasjoner kombineres til en enkelt formulering for å muliggjøre forbedret tunabilitet og materialfunksjonalitet 8,10,12,13. Disse viktige egenskapene har motivert den raske utvidelsen av granulær hydrogelutvikling de siste årene.

Det finnes en rekke metoder tilgjengelig for å danne mikrogeler mot granulær hydrogelproduksjon, hver med sine egne fordeler og ulemper. For eksempel dannes mikrogeler ofte av vann-i-olje-emulsjoner ved hjelp av dråpemikrofluidikk 4,11,13,14,15,16,17, batchemulsjoner 7,18,19,20,21,22 eller elektrospraying 6,23, 24,25. Disse metodene gir sfæriske mikrogeler med enten ensartede (mikrofluidikk) eller polydisperse (batchemulsjoner, elektrospraying) diametre. Det er noen begrensninger i disse vann-i-olje emulsjon fabrikasjonsmetoder, inkludert potensielt lav-gjennomstrømning produksjon, behovet for lav viskositet hydrogel forløper løsninger, og høye kostnader og ressurser for oppsett. I tillegg kan disse protokollene kreve harde oljer og overflateaktive stoffer som må vaskes fra mikrogelene ved hjelp av prosedyrer som legger til behandlingstrinn, og kan være vanskelig å oversette til sterile forhold for biomedisinske applikasjoner i mange laboratorier. Fjerning av behovet for vann-i-olje-emulsjoner, (foto)litografi kan også brukes, hvor mugg eller fotomasker brukes til å kontrollere herding av mikrogeler fra hydrogelforløperløsninger 1,26,27. I likhet med mikrofluidikk kan disse metodene være begrenset i produksjonsgjennomstrømningen, noe som er en stor utfordring når store volumer er nødvendig.

Som et alternativ til disse metodene har mekanisk fragmentering av bulkhydrogeler blitt brukt til å fremstille mikrogeler med uregelmessige størrelser 19,28,29,30,31,32. For eksempel kan bulkhydrgeler forhåndsdannes og deretter overføres gjennom masker eller sikter for å danne fragmenterte mikrogeler, en prosess som til og med har blitt gjort i nærvær av celler i mikrogelstrenger33,34. Bulk hydrogeler har også blitt behandlet i mikrogeler med mekaniske forstyrrelser ved hjelp av teknikker som sliping med mørtel og pestle eller gjennom bruk av kommersielle blendere 35,36,37. Andre har også brukt mekanisk agitasjon under hydrogeldannelse for å fremstille fragmenterte mikrogeler (dvs. væskegeler)31.

Metodene heri utvider disse mekaniske fragmenteringsteknikkene og presenterer en enkel tilnærming for å fremstille mikrogeler med ekstruderingsfragmentering, ved hjelp av fotocrosslinkable hyaluronsyre (HA) hydrogeler som eksempel. Ekstruderingsfragmentering bruker bare sprøyter og nåler til å fremstille fragmenterte mikrogeler i en rimelig, høy gjennomstrømning og lett skalerbar metode som passer for et bredt spekter av hydrogeler19,32. Videre er metoder for å montere disse fragmenterte mikrogelene i granulære hydrogeler beskrevet ved hjelp av enten sentrifugering (lav pakking) eller vakuumdrevet filtrering (høy pakking). Til slutt diskuteres anvendelsen av disse fragmenterte granulære hydrogelene for bruk som ekstruderingstrykkblekk. Målet med denne protokollen er å introdusere enkle metoder som er tilpasningsdyktige til et bredt utvalg av hydrogeler og kan implementeres i praktisk talt alle laboratorier som er interessert i granulære hydrogeler.

Protocol

1. Fabrikasjon av bulkhydrgeler inne i en sprøyte ved hjelp av fotocrosslinking MERK: En oversikt over bulkhydrgelproduksjon inne i en sprøyte ved hjelp av fotocrosslinking er vist i figur 1. Denne protokollen bruker norbornene-modifisert hyaluronsyre (NorHA) til å fremstille bulkhydrgeler ved hjelp av en fotomediert tiol-ene reaksjon. Detaljerte prosedyrer for syntesen av NorHA er beskrevet andre steder38. Denne protokoll…

Representative Results

Representative resultater fra disse protokollene er vist i figur 3 og figur 6. Ekstruderingsfragmentering gir mikrogeler med hakkede, polygonformer med diametre fra 10-300 μm (figur 3). Videre varierer sirkulariteten fra 0,2 (ikke sirkulær) til nesten 1 (perfekt sirkel), og størrelsesforholdet varierer fra 1-3 (figur 3). Disse parametrene beskriver de uregelmessige og hakkede mikrogelformene dannet a…

Discussion

Heri beskrives metoder for å fremstille granulære hydrogeler ved hjelp av ekstruderingsfragmenterte mikrogeler og pakking ved enten sentrifugering eller vakuumdrevet filtrering. Sammenlignet med andre mikrogel fabrikasjonsmetoder (dvs. mikrofluidikk, batchemulsjoner, elektrospraying, fotolitografi), er ekstruderingsfragmenteringsmikrogelproduksjon svært rask, rimelig, lett skalerbar og mottagelig for et bredt utvalg av hydrogelsystemer. Videre er denne protokollen svært repeterbar med minimal batch-til-batch variasjo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation gjennom UPenn MRSEC-programmet (DMR-1720530) og stipendiatstillinger (til V.G.M og M.E.P.) og National Institutes of Health (R01AR077362 til J.A.B.).

Materials

15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube Corning 430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) Fisher Scientific 14-823-435 Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") Grainger 5FVH5 Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") Grainger 5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") Grainger 5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 14190-250 Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm Millipore GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope Various Vendors To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Extrusion printer Custom-built Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters Fisher Scientific 05-888-107 Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) Sigma-Aldrich 52471
Glass microscope slide Various Vendors
ImageJ National Institutes of Health "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps Integrated Dispensin g Solutions 9991329
Metal spatula for scooping Various Vendors
Microcentrifuge Various Vendors Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl Microsoft Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System Excelitas Technologies S2000 Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate Fisher Scientific FB966C Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer Various Vendors
Repetier Host Hot-World GmbH & Co. KG 3D printing software
Screw-based extrusion printer Various Vendors This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software Dassault Systèmes SolidWorks Corporation Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses) Various Vendors
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1 (November 2020), 100008 (2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  9. Xin, S. et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), eabk3087 (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  11. Qazi, T. H. et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S. et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
  14. Sheikhi, A. et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192 (September 2018), 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R. et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q. et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232 (December 2019), 119725 (2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F. et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A. et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H. et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L. et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3) 035004 (2013).
  28. Gehlen, D. B. et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  30. Hsu, C. C. et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R. et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
  32. Zhang, H. et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A. et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
  34. Kessel, B. et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
  35. Hinton, T. J. et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N. et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G. et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 2201115 (2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. In Press (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N. et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, e00069 (2019).
  45. Skardal, A. et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 110, 53606 (2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 131, 56372 (2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3 (November 2017), 49-61 (2018).
  48. Ding, A. et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), e2109394 (2022).

Tags

FragmentingBulk HydrogelsGranular HydrogelsBiomedical ApplicationsBiomaterialsMethodAccessInnovationChemistryLaboratorySyringePrecursor SolutionPlungerTip CapPipette
check_url/63867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Muir, V. G., Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (183), e63867, doi:10.3791/63867 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image