Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden
Summary
Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.
Abstract
Entomopathogene nematoden in de geslachten Heterorhabditis en Steinernema zijn obligate parasieten van insecten die in de bodem leven. Het belangrijkste kenmerk van hun levenscyclus is de mutualistische associatie met respectievelijk de bacteriën Photorhabdus en Xenorhabdus. De nematodenparasieten zijn in staat om geschikte insectengastheren te lokaliseren en binnen te dringen, de immuunrespons van insecten te ondermijnen en zich efficiënt te vermenigvuldigen om de volgende generatie te produceren die actief op nieuwe insectenjassen zal jagen om te infecteren. Vanwege de eigenschappen van hun levenscyclus zijn entomopathogene nematoden populaire biologische bestrijders, die in combinatie met insecticiden worden gebruikt om destructieve landbouwinsectenplagen te bestrijden. Tegelijkertijd vertegenwoordigen deze parasitaire nematoden een onderzoeksinstrument om de pathogeniteit van nematoden te analyseren en anti-nematoderesponsen te hosten. Dit onderzoek wordt geholpen door de recente ontwikkeling van genetische technieken en transcriptomische benaderingen voor het begrijpen van de rol van nematoden uitgescheiden moleculen tijdens infectie. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven over het handhaven van entomopathogene nematoden en het gebruik van een gen knockdown-procedure. Deze methodologieën bevorderen verder de functionele karakterisering van entomopathogene nematodeninfectiefactoren.
Introduction
Het onderzoek naar entomopathogene nematoden (EPN) is de afgelopen jaren geïntensiveerd, voornamelijk vanwege het nut van deze parasieten in geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën en hun betrokkenheid bij fundamenteel biomedisch onderzoek 1,2. Recente studies hebben EPN vastgesteld als modelorganismen om de genetische componenten van nematoden te onderzoeken die worden geactiveerd tijdens de verschillende stadia van het infectieproces. Deze informatie geeft kritische aanwijzingen over de aard en het aantal moleculen dat door de parasieten wordt uitgescheiden om de fysiologie van de gastheer te veranderen en de aangeboren immuunrespons van het insect te destabiliseren 3,4. Tegelijkertijd wordt deze kennis vaak aangevuld met nieuwe details over het type immuunsignaleringsroutes van insectengasten en de functies die ze reguleren om de binnenkomst en verspreiding van de pathogenen te beperken 5,6. Het begrijpen van deze processen is cruciaal voor het bedenken van beide zijden van het dynamische samenspel tussen EPN en hun insectengastheren. Een betere waardering van de gastheerrelatie tussen EPN en insecten zal ongetwijfeld vergelijkbare studies met parasitaire nematoden van zoogdieren vergemakkelijken, wat kan leiden tot de identificatie en karakterisering van infectiefactoren die interfereren met het menselijk immuunsysteem.
De EPN-nematoden Heterorhabditis sp. en Steinernema sp. kunnen een breed scala aan insecten infecteren en hun biologie is eerder intensief bestudeerd. De twee nematodenparasieten verschillen in hun voortplantingswijze, waarbij heterorhabditis zelfbevrucht is en Steinernema amphimictische reproductie ondergaat, hoewel onlangs S. hermafroditum zich heeft voortgeplant door zelfbevruchting van hermafrodieten of door parthenogenese 7,8,9. Een ander verschil tussen Heterorhabditis en Steinernema-nematoden is hun symbiotische mutualisme met twee verschillende geslachten van Gram-negatieve bacteriën, respectievelijk Photorhabdus en Xenorhabdus, die beide krachtige pathogenen van insecten zijn. Deze bacteriën worden aangetroffen in het vrijlevende en niet-voedende infectieuze juveniele (IJ) stadium van het EPN, die gevoelige gastheren detecteren, toegang krijgen tot de insectenhemocoel waar ze hun geassocieerde bacteriën vrijgeven die zich snel repliceren en insectenweefsels koloniseren. Zowel het EPN als hun bacteriën produceren virulentiefactoren die de afweer van insecten ontwapenen en de homeostase aantasten. Na de dood van insecten ontwikkelen de nematode-IJs zich tot volwassen EPN en voltooien ze hun levenscyclus. Een nieuw cohort van IJs gevormd als reactie op voedselgebrek en overbevolking in het insectenkadaver duikt uiteindelijk op in de grond om te jagen op geschikte gastheren 9,10,11,12.
Hier wordt een efficiënt protocol beschreven voor het onderhouden, versterken en genetisch manipuleren van EPN-nematoden. In het bijzonder schetst het protocol de replicatie van symbiotische H. bacteriophora en S. carpocapsae IJs, de generatie van axeenaaltjes-IJs, de productie van H. bacteriophora hermafrodieten voor micro-injectie, de bereiding van het dsRNA en de micro-injectietechniek. Deze methoden zijn essentieel voor het begrijpen van de moleculaire basis van pathpathogeniteit van nematoden en gastheer-anti-nematodenimmuniteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het begrijpen van de moleculaire basis van entomopathogene nematodeninfectie en insecten-anti-nematodenimmuniteit vereist de scheiding van de parasieten van de mutualistisch geassocieerde bacteriën 13,15,16. De entomopathogene nematoden H. bacteriophora en S. carpocapsae leven samen met respectievelijk de Gram-negatieve bacteriën P. luminescens en X. nematophila 17. V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken leden van het Department of Biological Sciences aan de George Washington University voor het kritisch lezen van het manuscript. Alle grafische figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender. Onderzoek in de I. E., J. H. en D. O’H. laboratoria zijn ondersteund door George Washington University en Columbian College of Arts and Sciences faciliteren fondsen en cross-disciplinaire onderzoeksfondsen.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
