Summary

Культивирование и генетическое манипулирование энтомопатогенными нематодами

Published: March 31, 2022
doi:

Summary

Энтомопатогенные нематоды живут в симбиозе с бактериями и вместе они успешно заражают насекомых, подрывая их врожденную иммунную систему. Для содействия исследованиям генетической основы нематодной инфекции описаны методы поддержания и генетического манипулирования энтомопатогенными нематодами.

Abstract

Энтомопатогенные нематоды в родах Heterorhabditis и Steinernema являются облигатными паразитами насекомых, обитающих в почве. Основной характеристикой их жизненного цикла является мутуалистическая ассоциация с бактериями Photorhabdus и Xenorhabdus соответственно. Паразиты-нематоды способны находить и проникать в подходящих насекомых-хозяев, подрывать иммунный ответ насекомых и эффективно размножаться, чтобы произвести следующее поколение, которое будет активно охотиться на новую добычу насекомых для заражения. Благодаря свойствам своего жизненного цикла, энтомопатогенные нематоды являются популярными средствами биологического контроля, которые используются в сочетании с инсектицидами для борьбы с разрушительными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями. Одновременно эти паразитические нематоды представляют собой исследовательский инструмент для анализа патогенности нематод и реакций хозяина против нематод. Этому исследованию способствует недавняя разработка генетических методов и транскриптомных подходов для понимания роли молекул, секретируемых нематодами, во время инфекции. Здесь приведен подробный протокол по поддержанию энтомопатогенных нематод и использованию процедуры нокдауна генов. Эти методологии дополнительно способствуют функциональной характеристике энтомопатогенных факторов инфекции нематод.

Introduction

Исследования энтомопатогенных нематод (EPN) активизировались за последние несколько лет в первую очередь из-за полезности этих паразитов в комплексных стратегиях борьбы с вредителями и их участия в фундаментальных биомедицинских исследованиях 1,2. Недавние исследования установили EPN в качестве модельных организмов, в которых можно исследовать генетические компоненты нематод, которые активируются на разных стадиях инфекционного процесса. Эта информация дает критические подсказки о природе и количестве молекул, секретируемых паразитами, чтобы изменить физиологию хозяина и дестабилизировать врожденный иммунный ответ насекомых 3,4. В то же время эти знания обычно дополняются новыми подробностями о типе иммунных сигнальных путей насекомого-хозяина и функциях, которые они регулируют, чтобы ограничить проникновение и распространение патогенов 5,6. Понимание этих процессов имеет решающее значение для представления обеих сторон динамического взаимодействия между EPN и их насекомыми-хозяевами. Лучшая оценка отношений между EPN и насекомым-хозяином, несомненно, облегчит аналогичные исследования с паразитическими нематодами млекопитающих, что может привести к выявлению и характеристике инфекционных факторов, которые мешают иммунной системе человека.

Нематоды EPN Heterorhabditis sp. и Steinernema sp. могут заражать широкий спектр насекомых, и их биология была интенсивно изучена ранее. Два паразита-нематоды различаются по способу размножения: гетерорхабдит самооплодотворяется, а Steinernema подвергается амфимическому размножению, хотя недавно было показано, что S. hermaphroditum размножается путем самооплодотворения гермафродитов или партеногенеза 7,8,9. Другим отличием нематод Heterorhabditis и Steinernema является их симбиотический мутуализм с двумя различными родами грамотрицательных бактерий, Photorhabdus и Xenorhabdus, соответственно, которые являются мощными патогенами насекомых. Эти бактерии обнаруживаются на стадии свободноживущей и непитающейся инфекционной ювенильной (IJ) EPN, которая обнаруживает восприимчивых хозяев, получает доступ к гемокоэлю насекомых, где они высвобождают свои ассоциированные бактерии, которые быстро реплицируются, и колонизируют ткани насекомых. Как EPN, так и их бактерии производят факторы вирулентности, которые обезоруживают защиту насекомых и ухудшают гомеостаз. После смерти насекомых НЕМАТОДы развиваются, чтобы стать взрослыми EPN и завершить свой жизненный цикл. Новая когорта ИД, сформированная в ответ на лишение пищи и перенаселенность в трупе насекомых, наконец, появляется в почве, чтобы охотиться на подходящих хозяев 9,10,11,12.

Здесь описан эффективный протокол для поддержания, усиления и генетического манипулирования нематодами EPN. В частности, протокол описывает репликацию симбиотических H. bacteriophora и S. carpocapsae IJs, генерацию аксеновых нематод IJ, производство H. bacteriophora hermaphrodites для микроинъекции, получение дцРНК и технику микроинъекции. Эти методы необходимы для понимания молекулярной основы патогенности нематод и иммунитета хозяина против нематод.

Protocol

1. Производство симбиотических нематод инфекционных молодей Накройте чашку Петри (10 см) листом фильтровальной бумаги и добавьте примерно 10-15 личинок Galleria mellonella (рисунок 1A). Используя пипетку, дозируйте 2 мл воды, содержащей около 25-50 IJ на 10 мкл сусп…

Representative Results

Для оценки состояния нематод H. bacteriophora , прошедших аксенизацию, было определено наличие или отсутствие бактериальных колоний P. luminescens в II. Для этого была собрана гранула из примерно 500 IJ, которые ранее были стерилизованы и гомогенизированы в PBS. Положительное контрольное лечени…

Discussion

Понимание молекулярной основы энтомопатогенной нематодной инфекции и иммунитета насекомых против нематод требует отделения паразитов от мутуалистически связанных бактерий 13,15,16. Энтомопатогенные нематоды H. bacteriophora и S. carpocapsae<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона за критическое прочтение рукописи. Все графические рисунки были сделаны с помощью BioRender. Исследования в I. E., J. H. и D. O’H. лаборатории были поддержаны Университетом Джорджа Вашингтона и Колумбийским колледжем искусств и наук, содействующими фондам и фондам междисциплинарных исследований.

Materials

Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Play Video

Cite This Article
Heryanto, C., Ratnappan, R., O’Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

View Video