Summary

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Published: March 31, 2022
doi:

Summary

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Abstract

Nematoides entomopatômicos nos gêneros Heterorhabditis e Steinernema são parasitas obrigatórios de insetos que vivem no solo. A principal característica de seu ciclo de vida é a associação mutualista com as bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente. Os parasitas nematoides são capazes de localizar e entrar em hospedeiros de insetos adequados, subverter a resposta imune do inseto e multiplicar-se eficientemente para produzir a próxima geração que irá ativamente caçar novas presas de insetos para infectar. Devido às propriedades de seu ciclo de vida, nematoides entomopatômicos são agentes de controle biológico popular, que são usados em combinação com inseticidas para controlar pragas destrutivas de insetos agrícolas. Simultaneamente, esses nematoides parasitas representam uma ferramenta de pesquisa para analisar a patogenicidade nematoide e hospedar respostas anti-nematóides. Esta pesquisa é auxiliada pelo desenvolvimento recente de técnicas genéticas e abordagens transcriômicas para entender o papel de moléculas secretas de nematoide durante a infecção. Aqui, um protocolo detalhado sobre a manutenção de nematoides entomopatômicos e o uso de um procedimento de knockdown genético é fornecido. Essas metodologias promovem ainda mais a caracterização funcional dos fatores de infecção por nematoides entomopatômicos.

Introduction

As pesquisas sobre nematoides entomopatômicos (EPN) têm se intensificado nos últimos anos devido principalmente à utilidade desses parasitas em estratégias integradas de manejo de pragas e seu envolvimento em pesquisas biomédicas básicas 1,2. Estudos recentes estabeleceram a EPN como organismos modelo para examinar os componentes genéticos do nematoide que são ativados durante os diferentes estágios do processo de infecção. Essas informações fornecem pistas críticas sobre a natureza e o número de moléculas secretadas pelos parasitas para alterar a fisiologia hospedeira e desestabilizar a resposta imune inata do inseto 3,4. Simultaneamente, esse conhecimento é comumente complementado por novos detalhes sobre o tipo de vias de sinalização imunológica do hospedeiro de insetos e as funções que regulam para restringir a entrada e a disseminação dos patógenos 5,6. Entender esses processos é crucial para vislumbrar ambos os lados da interação dinâmica entre a EPN e seus hospedeiros de insetos. Uma melhor apreciação da relação hospedeiro epn-inseto facilitará, sem dúvida, estudos semelhantes com nematoides parasiticos mamíferos, o que pode levar à identificação e caracterização de fatores infeccionais que interferem no sistema imunológico humano.

Os nematoides da EPN Heterorhabditis sp. e Steinernema sp. podem infectar uma ampla gama de insetos, e sua biologia tem sido intensamente estudada anteriormente. Os dois parasitas nematoides diferem em seu modo de reprodução, com heterorhabdite sendo auto-fertilizado e Steinernema submetido à reprodução anfímica, embora recentemente S. hermaphroditum tenha sido mostrado para se reproduzir pela auto-fertilização de hermafroditas ou através da partenogênese 7,8,9. Outra diferença entre heterorhabditis e nematoides Steinernema é seu mutualismo simbiótico com dois gêneros distintos de bactérias Gram-negativas, Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente, que são patógenos potentes de insetos. Essas bactérias são encontradas na fase juvenil infecciosa (IJ) da EPN, que detecta hospedeiros suscetíveis, têm acesso ao hemocoel de insetos onde liberam suas bactérias associadas que se replicam rapidamente, e colonizam tecidos de insetos. Tanto a EPN quanto suas bactérias produzem fatores de virulência que desarmam as defesas de insetos e prejudicam a homeostase. Após a morte dos insetos, os IJs nematode desenvolvem-se para se tornarem EPN adultos e completarem seu ciclo de vida. Uma nova coorte de IJs formados em resposta à privação de alimentos e superlotação dentro do cadáver de insetos finalmente emerge no solo para caçar hospedeiros adequados 9,10,11,12.

Aqui, é descrito um protocolo eficiente para manter, amplificar e manipular geneticamente nematoides EPN. Em particular, o protocolo descreve a replicação de IJs simbióticos H. bacteriophora e S. carpocapsae , a geração de IJs de nematoides axenic, a produção de hermafroditas H. bacteriophora para microinjeção, a preparação do dsRNA e a técnica de microinjeção. Esses métodos são essenciais para a compreensão da base molecular da patogenicidade nematode e da imunidade anti-nematode hospedeira.

Protocol

1. Produção de infanto-juvenis simbióticos Cubra uma placa de Petri (10 cm) com um pedaço de papel filtro e adicione aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A). Usando uma pipeta, dispense 2 mL de água contendo cerca de 25-50 IJs por suspensão de 10 μL nos vermes de cera. Guarde a placa de Petri em um armário em temperatura ambiente. Dependendo da umidade do papel filtro, adicione 1-2 mL de água a cada 2 di…

Representative Results

Para avaliar o estado dos nematoides de H. bacteriophora que passaram pela axenização, foi determinada a presença ou ausência de colônias bacterianas de P. luminescens em IJs. Para isso, foi coletada uma pelota de aproximadamente 500 IJs que haviam sido esterilizados e homogeneizados anteriormente na PBS. O tratamento de controle positivo consistia em uma pelota de aproximadamente 500 IJs da cultura nematoide contendo bactérias simbióticas P. luminescens . As pelotas de nematoides de con…

Discussion

Compreender a base molecular da infecção entomopatômica e imunidade anti-nematode de insetos requer a separação dos parasitas das bactérias mutuamente associadas 13,15,16. Os nematoides entomopatômicos H. bacteriophora e S. carpocapsae vivem junto com as bactérias Gram-negativas P. luminescens e X. nematophila, respectivamente17. Ambas as espécies bacterianas t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos membros do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade George Washington pela leitura crítica do manuscrito. Todas as figuras gráficas foram feitas usando BioRender. Pesquisa no I.E., J.H., e D. O’H. laboratórios têm sido apoiados pela Universidade George Washington e pela Columbian College of Arts and Sciences facilitando fundos e Fundos de Pesquisa Interdisciplinar.

Materials

Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

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Heryanto, C., Ratnappan, R., O’Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

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