Odling och genetiskt manipulerande entomopatogena nematoder
Summary
Entomopatogena nematoder lever i symbios med bakterier och tillsammans infekterar de framgångsrikt insekter genom att undergräva deras medfödda immunförsvar. För att främja forskning om den genetiska grunden för nematodinfektion beskrivs metoder för att upprätthålla och genetiskt manipulera entomopatogena nematoder.
Abstract
Entomopatogena nematoder i släkten Heterorhabditis och Steinernema är obligatoriska parasiter av insekter som lever i jorden. Huvudkarakteristiken för deras livscykel är den mutualistiska föreningen med bakterierna Photorhabdus respektive Xenorhabdus. Nematodparasiterna kan lokalisera och komma in i lämpliga insektsvärdar, undergräva insektsimmunsvaret och föröka sig effektivt för att producera nästa generation som aktivt kommer att jaga nya insektsbyten att infektera. På grund av egenskaperna hos deras livscykel är entomopatogena nematoder populära biologiska bekämpningsmedel, som används i kombination med insekticider för att bekämpa destruktiva jordbruksinsekter. Samtidigt representerar dessa parasitiska nematoder ett forskningsverktyg för att analysera nematodpatogenitet och vara värd för anti-nematodsvar. Denna forskning stöds av den senaste utvecklingen av genetiska tekniker och transkriptomiska metoder för att förstå rollen som nematod utsöndrade molekyler under infektion. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll om upprätthållande av entomopatogena nematoder och användning av ett gen knockdown-förfarande. Dessa metoder främjar ytterligare den funktionella karakteriseringen av entomopatogena nematodinfektionsfaktorer.
Introduction
Forskning om entomopatogena nematoder (EPN) har intensifierats under de senaste åren, främst på grund av nyttan av dessa parasiter i integrerade skadedjursbekämpningsstrategier och deras engagemang i grundläggande biomedicinsk forskning 1,2. Nya studier har etablerat EPN som modellorganismer för att undersöka de nematodgenetiska komponenterna som aktiveras under de olika stadierna av infektionsprocessen. Denna information ger kritiska ledtrådar om arten och antalet molekyler som utsöndras av parasiterna för att förändra värdfysiologin och destabilisera insektens medfödda immunsvar 3,4. Samtidigt kompletteras denna kunskap vanligtvis med nya detaljer om typen av insektsvärds immunsignalvägar och de funktioner de reglerar för att begränsa patogenernas inträde och spridning 5,6. Att förstå dessa processer är avgörande för att föreställa sig båda sidor av det dynamiska samspelet mellan EPN och deras insektsvärdar. Bättre uppskattning av EPN-insektsvärdförhållandet kommer utan tvekan att underlätta liknande studier med däggdjursparasitiska nematoder, vilket kan leda till identifiering och karakterisering av infektionsfaktorer som stör det mänskliga immunsystemet.
EPN-nematoderna Heterorhabditis sp. och Steinernema sp. kan infektera ett brett spektrum av insekter, och deras biologi har studerats intensivt tidigare. De två nematodparasiterna skiljer sig åt i sitt reproduktionssätt med Heterorhabditis som självbefruktad och Steinernema genomgår amphimisk reproduktion, även om S. hermafroditum nyligen visade sig reproducera genom självbefruktning av hermafroditer eller genom partenogenes 7,8,9. En annan skillnad mellan Heterorhabditis och Steinernema nematoder är deras symbiotiska mutualism med två distinkta släkten av gramnegativa bakterier, Photorhabdus respektive Xenorhabdus, som båda är potenta patogener av insekter. Dessa bakterier finns i det fritt levande och icke-matande infektiösa juvenila (IJ) -stadiet i EPN, som upptäcker mottagliga värdar, får tillgång till insektshemokolen där de släpper ut sina associerade bakterier som replikerar snabbt och koloniserar insektsvävnader. Både EPN och deras bakterier producerar virulensfaktorer som avväpnar insektsförsvar och försämrar homeostasen. Efter insektsdöd utvecklas nematoden IJs till att bli vuxen EPN och slutföra sin livscykel. En ny kohort av IJs som bildats som svar på matbrist och överbeläggning inom insektskadavret dyker äntligen upp i jorden för att jaga lämpliga värdar 9,10,11,12.
Här beskrivs ett effektivt protokoll för att upprätthålla, förstärka och genetiskt manipulera EPN-nematoder. I synnerhet beskriver protokollet replikationen av symbiotiska H. bakterioforer och S. carpocapsae IJs, genereringen av axeniska nematode-IJs, produktionen av H. bakteriophora-hermafroditer för mikroinjektion, beredningen av dsRNA och mikroinjektionstekniken. Dessa metoder är väsentliga för att förstå den molekylära grunden för nematodpatogenitet och värd-anti-nematodimmunitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att förstå den molekylära grunden för entomopatogen nematodinfektion och insektsanti-nematodimmunitet kräver separation av parasiterna från de mutualistiskt associerade bakterierna 13,15,16. De entomopatogena nematoderna H. bacteriophora och S. carpocapsae lever tillsammans med de gramnegativa bakterierna P. luminescens respektive X. nematophila 17. Båda bakterie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar av institutionen för biologiska vetenskaper vid George Washington University för kritisk läsning av manuskriptet. Alla grafiska figurer gjordes med BioRender. Forskning i I. E., J. H. och D. O’H. laboratorier har fått stöd av George Washington University och Columbian College of Arts and Sciences som underlättar medel och tvärvetenskapliga forskningsfonder.
Materials
| Agarose | VWR | 97062-244 | |
| Ambion Megascript T7 Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1333 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | 611770250 | |
| Cell culture flask T25 | Fisher Scientific | 156367 | |
| Cell culture flask T75 | Fisher Scientific | 156499 | |
| ChoiceTaq Mastermix | Denville Scientific | C775Y42 | |
| Corn oil | VWR | 470200-112 | |
| Corn syrup | MP Biomedicals/VWR | IC10141301 | |
| Culture tube 10 mL | Fisher Scientific | 14-959-14 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | E7023 | |
| Falcon tube 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5252000021 | |
| Filter paper | VWR | 28320-100 | |
| Galleria mellonella waxorms | Petco | – | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-553-464 | 50 x 24 mm |
| Halocarbon Oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inoculating loop | VWR | 12000-806 | |
| Kanamycin | VWR | 97062-956 | |
| Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-3 | 1.0 mm |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Leica DM IRB Inverted Research Microscope | Microscope Central | – | |
| MacConkey medium | Millipore-Sigma | M7408-250G | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
| Microcentrifuge tube | VWR | 76332-064 | 1.5 ml |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Needle syringe | VWR | BD305155 | 22G |
| Nutrient broth | Millipore-Sigma | 70122-100G | |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | |
| Partitioned Petri dish | VWR | 490005-212 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab |
| PCR primers | Azenta | – | |
| Pestle | Millipore-Sigma | BAF199230001 | Bel-Art Disposable Pestle |
| Petri dish 6 cm | VWR | 25384-092 | 60 x 15 mm |
| Petri dish 10 mm | VWR | 10799-192 | 35 x 10 mm |
| Proteose Peptone #3 | Thermo Fisher Scientific | 211693 | |
| Yeast extract | Millipore-Sigma | Y1625 |
References
- Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
- Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
- Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
- Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
- Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
- Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
- Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
- Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
- Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
- Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
- Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
- Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
- McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).
