من أسفل إلى أعلى في طرق المختبر لفحص التنظيم فوق الهيكلي ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وسلوك حساسية الانحناء للسبتين
Summary
Septins هي بروتينات هيكلية خلوية. تتفاعل مع الأغشية الدهنية ويمكن أن تستشعر ولكنها تولد أيضا انحناء الغشاء على مقياس الميكرون. نحن نصف في هذا البروتوكول منهجيات من أسفل إلى أعلى في المختبر لتحليل تشوهات الغشاء ، وربط السيتين الحساس للانحناء ، والبنية الفائقة لخيوط السيفتين.
Abstract
تحدث إعادة تشكيل الغشاء باستمرار في غشاء البلازما وداخل العضيات الخلوية. لتشريح دور البيئة بالكامل (الظروف الأيونية ، تركيبات البروتين والدهون ، انحناء الغشاء) والشركاء المختلفين المرتبطين بعمليات إعادة تشكيل غشاء محددة ، نتعهد في المختبر بنهج من أسفل إلى أعلى. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بالكشف عن دور بروتينات السيبتين المرتبطة بالأمراض الرئيسية. Septins هي بروتينات هيكلية خلوية أساسية ومنتشرة في كل مكان تتفاعل مع غشاء البلازما. وهي متورطة في انقسام الخلايا ، وحركية الخلية ، والتشكل العصبي ، وتكوين الحيوانات المنوية ، من بين وظائف أخرى. لذلك ، من المهم فهم كيفية تفاعل السيبتين وتنظيمها في الأغشية للحث لاحقا على تشوهات الغشاء وكيف يمكن أن تكون حساسة لانحناءات غشائية محددة. تهدف هذه المقالة إلى فك رموز التفاعل بين البنية الفائقة للسبتين على المستوى الجزيئي وإعادة تشكيل الغشاء التي تحدث على نطاق ميكرون. تحقيقا لهذه الغاية ، تم التعبير عن الخميرة الناشئة ، ومجمعات سبتين الثدييات بشكل مؤتلف وتنقيتها. ثم تم استخدام مزيج من الفحوصات في المختبر لتحليل التجميع الذاتي للسبتين في الغشاء. تم استخدام الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) ، وحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) ، وحويصلات unilamellar الكبيرة (LUVs) ، والركائز المتموجة لدراسة التفاعل بين التجميع الذاتي للسبتين ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وانحناء الغشاء.
Introduction
Septins هي بروتينات مكونة للخيوط الخلوية الهيكلية تتفاعل مع الأغشية الدهنية. Septins موجودة في كل مكان في حقيقيات النوى وضرورية للعديد من الوظائف الخلوية. وقد تم تحديدها على أنها المنظمين الرئيسيين لانقسام الخلايا في الخميرة الناشئة والثدييات 1,2. وهي تشارك في أحداث إعادة تشكيل الغشاء ، وتكوين الأهداب3 ، وتكوين الحيوانات المنوية4. داخل خلايا الثدييات ، يمكن أن تتفاعل السيبتين أيضا مع الأكتين والأنابيب الدقيقة5،6،7 في رابط من Rho GTPases (BORG) بطريقة تعتمدعلى 8. في الأنسجة المختلفة (الخلايا العصبية9 ، الأهداب3 ، الحيوانات المنوية10) ، تم تحديد septins كمنظمات لحواجز الانتشار للمكونات المرتبطة بالغشاء11. كما ثبت أن Septins تنظم تبييض الغشاء وتشكيل البروز12. Septins ، كونها بروتينات متعددة المهام ، متورطة في ظهور العديد من الأمراض السائدة13. ويرتبط سوء تنظيمها بظهور السرطانات14 والأمراض العصبية التنكسية15.
اعتمادا على الكائن الحي ، تتجمع العديد من الوحدات الفرعية septin (اثنان في Caenorhabditis elegans إلى 13 في البشر) لتشكيل مجمعات يختلف تنظيمها بطريقة تعتمد على الأنسجة16. تجمع لبنة بناء السيتين الأساسية من وحدتين إلى أربع وحدات فرعية ، موجودة في نسختين ويتم تجميعها ذاتيا بطريقة باليندرومية تشبه القضيب. في الخميرة الناشئة ، تكون السيبتين أوكتاميك17,18. في الموقع ، غالبا ما يتم توطين السيبتين في مواقع ذات انحناء ميكرومتر. تم العثور عليها في مواقع انقباض الانقسام ، في قاعدة الأهداب والتشعبات ، وفي حلقة الحيوانات المنوية19,20. في الغشاء ، يبدو دور السيبتين مزدوجا: فهي متورطة في إعادة تشكيل الطبقة الثنائية للدهون وفي الحفاظ على سلامة الغشاء21. وبالتالي ، فإن التحقيق في الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتينات المكونة لخيوط السيبتين و / أو الوحدات الفرعية في الغشاء أمر بالغ الأهمية لفهم دورها. لتشريح خصائص محددة من السيبتين في بيئة جيدة التحكم ، من أسفل إلى أعلى في المختبر النهج المناسبة. حتى الآن ، وصفت مجموعات قليلة فقط الخصائص الفيزيائية الحيوية للسبتين في المختبر20،22،23. وبالتالي ، بالمقارنة مع خيوط الهيكل الخلوي الأخرى ، فإن المعرفة الحالية حول سلوك السيبتين في المختبر لا تزال محدودة.
يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تحليل تنظيم خيوط السيبتين وإعادة تشكيل الغشاء وحساسية الانحناء19. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدم مزيج من أساليب الفحص البصري والمجهري الإلكتروني (المجهر الفلوري، والمجهر الإلكتروني المبرد [cryo-EM]، والمجهر الإلكتروني الماسح [SEM]). يتم تصور إعادة تشكيل غشاء الحويصلات أحادية الصفيحات العملاقة بحجم ميكرومتر (GUVs) باستخدام المجهر البصري الفلوري. يتم إجراء تحليل الترتيب والبنية الفائقة لخيوط السيتين المرتبطة بحويصلات الدهون باستخدام cryo-EM. يتم إجراء تحليل حساسية انحناء السيبتين باستخدام SEM ، من خلال دراسة سلوك خيوط السيتين المرتبطة بالطبقات الثنائية للدهون المدعومة بالمواد الصلبة المودعة على ركائز متموجة من الانحناءات المتغيرة ، مما يتيح تحليل حساسية الانحناء لكل من الانحناءات الإيجابية والسلبية. بالمقارنة مع التحليل السابق20,24 ، هنا ، نقترح استخدام مجموعة من الطرق لتحليل شامل لكيفية تجميع السيبتين ذاتيا ، وتشوه الغشاء بشكل تآزري ، ويكون حساسا للانحناء. ويعتقد أن هذا البروتوكول مفيد وقابل للتكيف مع أي بروتين خيطي يظهر تقاربا للأغشية.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر أعلاه ، تم استخدام خليط الدهون الذي يعزز دمج PI (4,5) P2 داخل الطبقة الثنائية للدهون وبالتالي يسهل التفاعلات بين غشاء السبعين. في الواقع ، لقد أظهرنا في مكان آخر25 أن سبتين الخميرة الناشئة تتفاعل مع الحويصلات بطريقة PI (4,5) P2 الخاصة. تم تعديل تركيبة الدهون هذه تجري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر باتريشيا باسيريو ودانيال ليفي على مشورتهما ومناقشاتهما المفيدة. استفاد هذا العمل من دعم الوكالة الوطنية للبحوث لتمويل مشروع “SEPTIME” ، ANR-13-JSV8-0002-01 ، ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 ، ومشروع “SEPTSCORT” ، ANR-20-CE11-0014-01. يتم تمويل B. Chauvin من قبل مدرسة الدكتوراه “ED564: Physique en Ile de France” ومؤسسة البحث العلمي. تم دعم K. Nakazawa من قبل جامعة السوربون (AAP Emergence). تم دعم G.H. Koenderink من قبل Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO / OCW) من خلال “BaSyC-Building a Synthetic Cell”. منحة الجاذبية (024.003.019). نشكر مقياس Labex Cell(n) (ANR-11-LABX0038) وباريس للعلوم والآداب (ANR-10-IDEX-0001-02). نشكر تصوير الخلايا والأنسجة (PICT-IBiSA) ، معهد كوري ، عضو البنية التحتية الوطنية الفرنسية للبحوث في فرنسا – التصوير الحيوي (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
References
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
