Méthodes in vitro ascendantes pour tester l’organisation ultrastructurale, le remodelage de la membrane et le comportement de sensibilité à la courbure des septines
Summary
Les septines sont des protéines cytosquelettiques. Ils interagissent avec les membranes lipidiques et peuvent détecter mais aussi générer une courbure de membrane à l’échelle du micron. Nous décrivons dans ce protocole des méthodologies in vitro ascendantes pour l’analyse des déformations membranaires, la liaison de la septine sensible à la courbure et l’ultrastructure du filament de septine.
Abstract
Le remodelage membranaire se produit constamment au niveau de la membrane plasmique et dans les organites cellulaires. Pour décortiquer complètement le rôle de l’environnement (conditions ioniques, compositions protéiques et lipidiques, courbure membranaire) et des différents partenaires associés à des processus spécifiques de remodelage membranaire, nous entreprenons des approches ascendantes in vitro . Ces dernières années, on a manifesté un vif intérêt pour révéler le rôle des protéines septines associées aux principales maladies. Les septines sont des protéines cytosquelettiques essentielles et omniprésentes qui interagissent avec la membrane plasmique. Ils sont impliqués dans la division cellulaire, la motilité cellulaire, la neuro-morphogenèse et la spermiogenèse, entre autres fonctions. Il est donc important de comprendre comment les septines interagissent et s’organisent au niveau des membranes pour induire ensuite des déformations membranaires et comment elles peuvent être sensibles à des courbures membranaires spécifiques. Cet article vise à déchiffrer l’interaction entre l’ultra-structure des septines au niveau moléculaire et le remodelage membranaire se produisant à l’échelle du micron. À cette fin, des complexes de levure bourgeonnante et de septine de mammifères ont été exprimés et purifiés de manière recombinante. Une combinaison de tests in vitro a ensuite été utilisée pour analyser l’auto-assemblage des septines au niveau de la membrane. Des bicouches lipidiques soutenues (SLB), des vésicules unilamellaires géantes (GUV), de grandes vésicules unilamellaires (LUV) et des substrats ondulés ont été utilisés pour étudier l’interaction entre l’auto-assemblage de la septine, le remodelage de la membrane et la courbure de la membrane.
Introduction
Les septines sont des protéines formant des filaments cytosquelettiques qui interagissent avec les membranes lipidiques. Les septines sont omniprésentes chez les eucaryotes et essentielles à de nombreuses fonctions cellulaires. Ils ont été identifiés comme les principaux régulateurs de la division cellulaire chez les levures bourgeonnantes et les mammifères 1,2. Ils sont impliqués dans les événements de remodelage membranaire, la ciliogenèse3 et la spermiogenèse4. Dans les cellules de mammifères, les septines peuvent également interagir avec l’actine et les microtubules 5,6,7 dans un liant de Rho GTPases (BORG) de manière 8. Dans divers tissus (neurones9, cils3, spermatozoïdes10), les septines ont été identifiées comme régulateurs des barrières de diffusion pour les composants liés à la membrane11. Il a également été démontré que les septines régulent le blebbing de la membrane et la formation de saillies12. Les septines, étant des protéines multitâches, sont impliquées dans l’émergence de diverses maladies répandues13. Leur mauvaise régulation est associée à l’émergence de cancers14 et de maladies neurodégénératives15.
Selon l’organisme, plusieurs sous-unités septines (deux chez Caenorhabditis elegans à 13 chez l’homme) s’assemblent pour former des complexes dont l’organisation varie de façon tissulaire16. Le bloc de construction septine de base rassemble deux à quatre sous-unités, présentes en deux exemplaires et auto-assemblées de manière palindromique en forme de tige. Dans la levure bourgeonnante, les septines sont octamériques17,18. In situ, les septines sont souvent localisées sur des sites à courbure micrométrique; On les trouve aux sites de constriction de division, à la base des cils et des dendrites, et à l’anneau des spermatozoïdes19,20. Au niveau de la membrane, le rôle des septines semble être double : elles sont impliquées dans le remodelage de la bicouche lipidique et dans le maintien de l’intégrité de la membrane21. Par conséquent, l’étude des propriétés biophysiques des protéines formant des filaments de septine et / ou des sous-unités à la membrane est cruciale pour comprendre leur rôle. Pour disséquer les propriétés spécifiques des septines dans un environnement bien contrôlé, des approches in vitro ascendantes sont appropriées. Jusqu’à présent, seuls quelques groupes ont décrit les propriétés biophysiques des septines in vitro20,22,23. Par conséquent, par rapport à d’autres filaments cytosquelettiques, les connaissances actuelles sur le comportement des septines in vitro restent limitées.
Ce protocole décrit comment l’organisation des filaments de septine, le remodelage de la membrane et la sensibilité à la courbure peuvent être analysés19. À cette fin, une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique (microscopie à fluorescence, cryo-microscopie électronique [cryo-EM] et microscopie électronique à balayage [MEB]) a été utilisée. Le remodelage membranaire de vésicules unilamellaires géantes (GUV) de taille micrométrique est visualisé à l’aide de la microscopie optique à fluorescence. L’analyse de l’arrangement et de l’ultrastructure des filaments de septine liés aux vésicules lipidiques est réalisée à l’aide de cryo-EM. L’analyse de la sensibilité à la courbure de la septine est réalisée à l’aide de MEB, en étudiant le comportement des filaments de septine liés aux bicouches lipidiques soutenues par des solides déposés sur des substrats ondulés de courbures variables, ce qui permet d’analyser la sensibilité à la courbure pour les courbures positives et négatives. Par rapport à l’analyse précédente20,24, nous proposons ici d’utiliser une combinaison de méthodes pour analyser en profondeur comment les septines peuvent s’auto-assembler, déformer la membrane de manière synergique et être sensibles à la courbure. Ce protocole est considéré comme utile et adaptable à toute protéine filamenteuse qui présente une affinité pour les membranes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué ci-dessus, un mélange lipidique a été utilisé qui améliore l’incorporation de PI(4,5)P2 dans la bicouche lipidique et facilite ainsi les interactions septine-membrane. En effet, nous avons montré ailleurs25 que les septines de levure bourgeonnantes interagissent avec les vésicules de manière spécifique à PI(4,5)P2. Cette composition lipidique a été ajustée empiriquement à partir du criblage de plusieurs compositions et est maintenant largement u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Patricia Bassereau et Daniel Lévy pour leurs précieux conseils et discussions. Ces travaux ont bénéficié du soutien de l’ANR (Agence Nationale de la Recherche) pour le financement du projet « SEPTIME », ANR-13-JSV8-0002-01, de l’ANR septimorf ANR-17-CE13-0014, et du projet « SEPTSCORT », ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin est financé par l’Ecole Doctorale « ED564: Physique en Ile de France » et la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa a été soutenu par Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink a été soutenu par la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) par le biais du « BaSyC-Building a Synthetic Cell ». Subvention de gravitation (024.003.019). Nous remercions le Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) et Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Nous remercions l’Imagerie Cellulaire et Tissulaire (PICT-IBiSA), Institut Curie, membre de l’Infrastructure Nationale de Recherche Français France-BioImagerie (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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