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Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/63889
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1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University,Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249,Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering,Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS),Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC),Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology,Czech Academy of Sciences, BIOCEV

Summary

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Abstract

막 리모델링은 원형질막과 세포 소기관 내에서 지속적으로 발생합니다. 환경 (이온 조건, 단백질 및 지질 조성물, 막 곡률)과 특정 막 재구성 과정과 관련된 다양한 파트너의 역할을 완전히 해부하기 위해 우리는 시험관 내 상향식 접근법을 수행합니다. 최근 몇 년 동안, 주요 질병과 관련된 셉틴 단백질의 역할을 밝히는 데 관심이 높아지고 있습니다. 셉틴은 원형질막과 상호작용하는 필수적이고 유비쿼터스 세포골격 단백질이다. 그들은 다른 기능들 중에서도 세포 분열, 세포 운동성, 신경 형태 형성 및 정자 형성에 연루되어 있습니다. 따라서 셉틴이 멤브레인에서 어떻게 상호 작용하고 조직되어 멤브레인 변형을 유도하고 특정 막 곡률에 어떻게 민감 할 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 이 기사는 분자 수준에서 셉틴의 초 구조와 미크론 규모로 발생하는 막 리모델링 사이의 상호 작용을 해독하는 것을 목표로합니다. 이를 위해, 싹트는 효모 및 포유동물 셉틴 복합체를 재조합적으로 발현하고 정제하였다. 이어서 , 시험관내 분석의 조합을 사용하여 막에서 셉틴의 자가조립을 분석하였다. 지지된 지질 이중층(SLBs), 거대한 유니라멜라 소포(GUVs), 큰 유니라멜라 소포(LUVs) 및 물결 모양의 기질을 사용하여 셉틴 자가조립, 막 재구성 및 막 곡률 사이의 상호작용을 연구하였다.

Introduction

셉틴은 지질막과 상호작용하는 세포골격 필라멘트 형성 단백질이다. 셉틴은 진핵생물에서 유비쿼터스이며 수많은 세포 기능에 필수적입니다. 이들은 신진 효모 및 포유류 1,2에서 세포 분열의 주요 조절자로 확인되었다. 그들은 막 재형성 사건, ciliogenesis3 및 정자 생성4에 관여합니다. 포유동물 세포 내에서, 셉틴은 또한 Rho GTPases (BORG)-의존성 방식8의 결합제에서 액틴 및 미세소관 5,6,7과 상호작용할 수 있다. 다양한 조직(뉴런9, 섬모3, 정자10)에서, 셉틴은 막 결합 성분(11)에 대한 확산 장벽의 조절자로서 확인되었다. 셉틴은 또한 막 블링 및 돌출부 형성(12)을 조절하는 것으로 나타났다. 멀티 태스킹 단백질인 셉틴은 다양한 유행하는 질병의 출현에 연루되어 있습니다13. 그들의 잘못된 조절은 암(14) 및 신경퇴행성 질환(15)의 출현과 관련이 있다.

유기체에 따라, 몇몇 셉틴 서브유닛들(예쁜꼬마선충에서 두 개에서 인간의 경우 13개까지)이 모여 조직 의존적 방식으로 조직이 변하는 복합체를 형성한다(16). 기본 septin 빌딩 블록은 두 개에서 네 개의 서브 유닛을 수집하며, 두 개의 사본으로 존재하며 막대 모양의 palindromic 방식으로 자체 조립됩니다. 신진 효모에서 셉틴은 옥타머17,18입니다. 계내에서, 셉틴은 종종 마이크로미터 곡률을 갖는 부위에 국한된다; 그들은 분열 수축 부위, 섬모와 덴드라이트의 기저부, 정자19,20의 환부에서 발견됩니다. 막에서, 셉틴의 역할은 이중적인 것으로 보인다: 그들은 지질 이중층을 재형성하고 막 완전성을 유지하는데 연루된다(21). 따라서 멤브레인에서 셉틴 필라멘트 형성 단백질 및 / 또는 서브 유닛의 생체 물리학 적 특성을 조사하는 것은 그 역할을 이해하는 데 중요합니다. 잘 조절된 환경에서 셉틴의 특정 특성을 해부하기 위해, 상향식 시험관내 접근법이 적절하다. 지금까지, 단지 몇몇 그룹만이 시험관내 셉틴 20,22,23의 생체물리학적 특성을 기술하였다. 따라서, 다른 세포골격 필라멘트와 비교하여, 시험관 내에서 셉틴의 거동에 대한 현재의 지식은 여전히 제한적이다.

이 프로토콜은 셉틴 필라멘트의 조직, 막 재구성 및 곡률 감도가 어떻게 분석될 수 있는지를 기술한다(19). 이를 위해, 광학 및 전자 현미경 검사 방법(형광 현미경, cryo-electron microscopy[cryo-EM] 및 주사 전자 현미경[SEM])의 조합이 사용되었다. 마이크로 미터 크기의 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)의 막 재구성은 형광 광학 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 지질 소포에 결합된 셉틴 필라멘트의 배열 및 초구조의 분석은 cryo-EM을 사용하여 수행된다. 셉틴 곡률 감도의 분석은 가변 곡률의 물결 모양의 기질에 증착 된 고체 지지형 지질 이중층에 결합 된 셉틴 필라멘트의 거동을 연구함으로써 SEM을 사용하여 수행되며, 이는 양의 곡률과 음의 곡률 모두에 대한 곡률 감도의 분석을 가능하게합니다. 이전 분석20,24와 비교하여, 여기서는 셉틴이 어떻게 자체 조립되고, 시너지 효과를 발휘하여 막을 변형시키고, 곡률에 민감 할 수 있는지 철저히 분석하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 것을 제안합니다. 이 프로토콜은 막에 대한 친화도를 표시하는 임의의 필라멘트 단백질에 유용하고 적응가능한 것으로 여겨진다.

Protocol

1. 거대한 유니라멜라 소포(GUV)를 이용한 막 재성형 결정 참고: 이 섹션에서 GUV는 세포 맥락에서 셉틴에 의해 유도될 가능성이 있는 막 변형을 모방하기 위해 생성된다. 실제로, 세포에서, 셉틴은 마이크로미터 곡률을 가진 부위에서 자주 발견된다. GUV는 몇 마이크로미터에서 수십 마이크로미터에 이르는 크기를 가지며 변형될 수 있습니다. 따라서 이들은 임의의 마…

Representative Results

GUV 변형셉틴과 함께 인큐베이션된 후 재성형된 GUVs의 전형적인 공초점 형광 이미지는 셉틴이 중합되는 조건에서 도 3에 표시된다. 베어 GUV(그림 3A)는 완벽하게 구형이었다. 50 nM 이상의 신진 효모 셉틴 필라멘트와 함께 인큐베이션시, 소포는 변형된 것처럼 보였다. 최대 100 nM 농도의 싹이 트인 효모 셉틴 옥타머까지, 소포는 패싯된 것처?…

Discussion

상기 언급된 바와 같이, 지질 혼합물이 지질 이중층 내에 PI(4,5)P2 혼입을 강화하고 따라서 셉틴-막 상호작용을 용이하게 하는 데 사용되었다. 실제로, 우리는 다른 곳에서 신진 효모 셉틴이 PI (4,5 ) P 2 특정 방식으로 소포와 상호 작용한다는 것을 다른곳에서 보여주었습니다. 이 지질 조성물은 다수의 조성물을 스크리닝하는 것으로부터 경험적으로 조정되었고, 현…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Patricia Bassereau와 Daniel Lévy에게 유용한 조언과 토론에 감사드립니다. 이 작업은 프로젝트 “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 및 프로젝트 “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01에 자금을 지원하기위한 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 지원으로부터 이익을 얻었습니다. B. Chauvin은 Ecole Doctorale “ED564 : Physique en Ile de France”와 Fondation pour lea Recherche Médicale이 자금을 지원합니다. K. Nakazawa는 Sorbonne Université (AAP Emergence)의 지원을 받았습니다. G.H. Koenderink는 ‘BaSyC-Building a Synthetic Cell’을 통해 Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW)의 지원을 받았습니다. 중력 교부금(024.003.019). Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038)과 Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02)에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스-바이오이미징(ANR10-INBS-04)의 회원인 세포 및 조직 이미징(PICT-IBiSA), Institut Curie에게 감사드립니다.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840035
Bath sonicator Elma Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide invitrogen, Thermo Fischer scientific 11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol Sigma Aldrich
Confocal microscope nikon spinning disk or confocal
Critical point dryer Leica microsystems CPD300
Deionized water generator MilliQ F1CA38083B MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051
Field Emission Gun SEM (FESEM) Carl Zeiss Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution Thermo Fischer scientific 50-262-19
High vacuum grease, Dow corning VWR
IMOD software https://bio3d.colorado.edu/imod/ software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids Eloise 01883-F
Lipids Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046
Metal evaporator Leica microsystems EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 Norland Products NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4% delta microscopies 19170
Osmometer Löser 15 M
Plasma cleaner Alcatel pascal 2005 SD
Plasma generator Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment leica microsystems EMGP
Transmission electron microscope Thermofischer Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22451 this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex VWR
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References

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In Vitro MethodsUltrastructural OrganizationMembrane ReshapingCurvature SensitivitySeptinsCytoskeletal FilamentsNorland Optical AdhesivePolydimethylsiloxaneSupported Lipid BilayerScanning Electron Microscopy

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Chauvin, B., Nakazawa, K., Beber, A., Di Cicco, A., Hajj, B., Iv, F., Mavrakis, M., Koenderink, G. H., Cabral, J. T., Trichet, M., Mangenot, S., Bertin, A. Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins. J. Vis. Exp. (186), e63889, doi:10.3791/63889 (2022).
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