הדמיה תלת-ממדית כמותית של תאים נגועים בטריפנוסומה קרוזי, אמסטיגוטים רדומים ותאי T באיברים מבהירים שלמים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור ושיטות אוטומטיות בסיוע תוכנה כדי להמחיש ולכמת במדויק טפילי טריפנוזומה קרוזי ותאי T מתרבים ורדומים באיברים ורקמות שלמים ומנוקים. טכניקות אלה מספקות דרך אמינה להעריך את תוצאות הטיפול ומציעות תובנות חדשות על אינטראקציות בין טפיל לפונדקאי.
Abstract
מחלת צ’אגאס היא פתולוגיה מוזנחת המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם, בעיקר באמריקה הלטינית. סוכן מחלת צ’אגאס, טריפנוסומה קרוזי (T. cruzi), הוא טפיל תוך תאי חובה עם ביולוגיה מגוונת שמדביקה כמה מיני יונקים, כולל בני אדם, וגורמת לפתולוגיות לב ועיכול. זיהוי אמין של זיהומים מסוג T. cruzi in vivo נחוץ זה מכבר כדי להבין את הביולוגיה המורכבת של מחלת צ’אגאס ולהעריך במדויק את התוצאות של משטרי טיפול. הפרוטוקול הנוכחי מדגים צינור משולב לכימות אוטומטי של תאים נגועים ב-T. cruzi באיברים משוחזרים ומסולקים בתלת-ממד. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מאפשרת הדמיה וכימות מדויקים של טפילי T. cruzi פעילים ורדומים ותאי השפעה חיסונית באיברים או רקמות שלמות. כמו כן, צינור CUBIC-HistoVision כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים אומץ בהצלחה. ניקוי רקמות בשילוב עם אימונוסטינינג תלת-ממדי מספק גישה בלתי משוחדת להערכה מקיפה של פרוטוקולי טיפול תרופתיים, משפר את הבנת הארגון התאי של רקמות נגועות ב-T. cruzi, וצפוי לקדם תגליות הקשורות לאנטי-T. תגובות חיסוניות של קרוזי , נזק לרקמות ותיקון במחלת צ’אגאס.
Introduction
מחלת צ’אגאס, הנגרמת על ידי הטפיל הפרוטוזואני T. cruzi, היא בין המחלות הטרופיות המוזנחות ביותר בעולם, וגורמת לכ-13,000 מקרי מוות בשנה. הזיהום מתקדם לעתים קרובות משלב אקוטי לכרוני ומייצר פתולוגיה לבבית אצל 30% מהחולים, כולל הפרעות קצב, אי ספיקת לב ומוות פתאומי 1,2. למרות התגובה החיסונית החזקה של הפונדקאי המתעוררת נגד הטפיל בשלב החריף, מספר נמוך של טפילים נמשך באופן כרוני לאורך כל חייו של הפונדקאי ברקמות כמו הלב ושרירי השלד. מספר גורמים, כולל התפרצות מאוחרת של תגובות חיסוניות נרכשות ונוכחות של צורות לא משוכפלות של הטפיל, עשויים לתרום ליכולת של T. cruzi למנוע חיסול מוחלט על ידי מערכת החיסון 3,4,5,6. יתר על כן, צורות רדומות שאינן משתכפלות של הטפיל מציגות רגישות נמוכה לתרופות טריפנוצידליות ועשויות להיות אחראיות בחלקן לכישלון הטיפול שנצפה במקרים רבים 7,8.
פיתוח טכניקות הדמיה חדשות מספק הזדמנות לקבל תובנה לגבי ההתפלגות המרחבית של הטפילים ברקמות הנגועות והקשר שלהם עם תאי החיסון המעורבים בשליטה שלהם. מאפיינים אלה חיוניים להבנה טובה יותר של תהליכי הדברת הטפילים על ידי מערכת החיסון ולמעקב אחר הטפילים הרדומים הנדירים הנמצאים ברקמות כרוניות.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM) היא אחת השיטות המקיפות והבלתי משוחדות ביותר להדמיה תלת-ממדית של רקמות או איברים גדולים ללא חתך דק. מיקרוסקופים בעלי יריעות אור מנצלים יריעה דקה של אור רק כדי לעורר את הפלואורופורים במישור המוקד, להפחית את הפוטו-לבניה והפוטוטוקסיות של דגימות, ולהקליט תמונות של אלפי שכבות רקמה באמצעות מצלמות אולטרה-מהירות. הרמה הגבוהה של שקיפות הרקמה הדרושה לחדירה נכונה של אור הלייזר לרקמות מתקבלת על ידי הומוגניזציה של מקדם השבירה (RI) לאחר דליפיזציה ודה-צביעה של הרקמות, מה שמפחית את פיזור האור ומעניק תמונות באיכות גבוהה ל-9,10,11.
גישות לניקוי רקמות פותחו להדמיה של עכברים שלמים 12,13,14, אורגנואידים 15,16,17, איברים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים מדווחים 18,19,20,21,22,23, ולאחרונה מספר מוגבל של רקמות אנושיות 24 . השיטות הנוכחיות לניקוי רקמות מסווגות לשלוש משפחות: (1) שיטות מבוססות ממסים אורגניים כגון פרוטוקולי DISCO 25,26, (2) שיטות מבוססות הידרוג’ל, כגון CLARITY27, ושיטות מימיות, כגון CUBIC (קוקטיילים ברורים ללא הפרעה להדמיית מוח/גוף וניתוח חישובי)18,19,28,29 . פרוטוקולים מעוקבים שומרים על צורת האיברים ושלמות הרקמות, ושומרים על הפלואורסצנטיות של חלבוני דיווח המבוטאים באופן אנדוגני. העדכון האחרון של טכניקה זו, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), מאפשר גם זיהוי של אפיטופים באמצעות נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים ותיוג DNA28.
בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בצינור CUBIC לאיתור T. cruzi המבטא חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות עכבר שלמות שהובהרו. רקמות שקופות אופטית צולמו על ידי LSFM, שוחזרו בתלת-ממד, והמספר הכולל המדויק של תאים נגועים ב-T. cruzi , אמסטיגוטים רדומים ותאי T לכל איבר כומתו באופן אוטומטי. כמו כן, פרוטוקול זה אומץ בהצלחה כדי לקבל תיוג אחיד של איברים מנוקים עם נוגדנים וכתמים גרעיניים. גישות אלה חיוניות להבנת ההתרחבות והבקרה של T. cruzi בפונדקאים נגועים והן שימושיות להערכה מלאה של טיפולים כימותרפיים ואימונו-תרפויטיים למחלת צ’אגאס.
Protocol
Representative Results
Discussion
היעדר הדמיה נרחבת של איברים שלמים של טפילים והתגובה החיסונית מגביל את הבנת המורכבות של יחסי הגומלין בין פונדקאי לטפיל ומעכב את הערכת הטיפולים למחלת צ’אגאס. המחקר הנוכחי אימץ את צינור ה-CUBIC כדי להבהיר ולהכתים איברים ורקמות שלמים של עכברים נגועים ב-T. cruzi.
מספר פרוטוקולים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אטסואו סוסאקי על עזרתם החשובה והמלצותיהם בנוגע לפרוטוקולים לניקוי רקמות ובדיקות חיסון. כמו כן, אנו מודים ל- M. Kandasamy מליבת המיקרוסקופיה הביו-רפואית CTEGD על התמיכה הטכנית באמצעות LSFM והדמיה קונפוקלית. אנו גם מודים לכל חברי קבוצת המחקר של טרלטון על ההצעות המועילות במהלך מחקר זה.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
