Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi
Summary
Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.
Abstract
Chagas hastalığı, başta Latin Amerika olmak üzere dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen ihmal edilmiş bir patolojidir. Chagas hastalığı ajanı Trypanosoma cruzi (T. cruzi), insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli türünü enfekte eden, kalp ve sindirim patolojilerine neden olan çeşitli biyolojiye sahip zorunlu bir hücre içi parazittir. Chagas hastalığının karmaşık biyolojisini anlamak ve tedavi rejimlerinin sonucunu doğru bir şekilde değerlendirmek için T. cruzi in vivo enfeksiyonlarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi uzun zamandır gereklidir. Mevcut protokol, 3D yeniden yapılandırılmış, temizlenmiş organlarda T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin otomatik olarak ölçülmesi için entegre bir boru hattı göstermektedir. Işık tabakası floresan mikroskopisi, tüm organ veya dokularda aktif olarak çoğalan ve uykuda olan T. cruzi parazitlerinin ve bağışıklık efektör hücrelerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Ayrıca, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle düzgün bir şekilde etiketlenmesini sağlamak için CUBIC-HistoVision boru hattı başarıyla kabul edildi. 3D immün boyama ile birlikte doku temizleme, ilaç tedavi protokollerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek, T. cruzi ile enfekte olmuş dokuların hücresel organizasyonunun anlaşılmasını geliştirmek için tarafsız bir yaklaşım sağlar ve Chagas hastalığında anti-T. cruzi immün yanıtları, doku hasarı ve onarımı ile ilgili keşifleri ilerletmesi beklenmektedir.
Introduction
Protozoan parazit T. cruzi’nin neden olduğu Chagas hastalığı, dünyanın en çok ihmal edilen tropikal hastalıkları arasındadır ve yılda yaklaşık 13.000 ölüme neden olmaktadır. Enfeksiyon sıklıkla akuttan kronik bir aşamaya ilerleyerek hastaların %30’unda kardiyak patoloji oluşturur ve buna aritmiler, kalp yetmezliği ve ani ölüm 1,2. Akut fazda parazite karşı ortaya çıkan güçlü konakçı bağışıklık tepkisine rağmen, konakçının yaşamı boyunca kalp ve iskelet kası gibi dokularda kronik olarak düşük sayıda parazit devam eder. Adaptif immün yanıtların gecikmiş başlangıcı ve parazitin replikasyon yapmayan formlarının varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörler, T. cruzi’nin bağışıklık sistemi tarafından tamamen ortadan kaldırılmasını önleme kapasitesine katkıda bulunabilir 3,4,5,6. Ayrıca, parazitin replikasyon yapmayan uykudaki formları, tripanosidal ilaçlara karşı düşük bir duyarlılık gösterir ve kısmen birçok durumda gözlenen tedavi başarısızlığından sorumlu olabilir 7,8.
Yeni görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi, enfekte dokulardaki parazitlerin mekansal dağılımı ve kontrollerinde yer alan bağışıklık hücreleri ile ilişkileri hakkında fikir edinme fırsatı sunmaktadır. Bu özellikler, bağışıklık sistemi tarafından parazit kontrol süreçlerinin daha iyi anlaşılması ve kronik dokularda bulunan nadir uyuyan parazitlerin izlenmesi için çok önemlidir.
Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), büyük doku veya organların ince kesitleme olmadan 3D görüntülenmesi için en kapsamlı ve tarafsız yöntemlerden biridir. Işık tabakası mikroskopları, yalnızca odak düzlemindeki floroforları uyarmak, örneklerin fotobeyazlatmasını ve fototoksisitesini azaltmak ve ultra hızlı kameralar kullanarak binlerce doku katmanının görüntülerini kaydetmek için ince bir ışık tabakası kullanır. Lazer ışığının dokulara uygun şekilde nüfuz etmesi için gerekli olan yüksek doku saydamlık seviyesi, doku delipidasyonu ve renk dejenerasyonunu takiben kırılma indisinin (RI) homojenize edilmesiyle elde edilir, bu da ışığın saçılmasını azaltır ve yüksek kaliteli görüntüler oluşturur 9,10,11.
Bütün farelerin12,13,14, organoidlerin15,16,17, muhabir floresan belirteçleri eksprese eden organların18,19,20,21,22,23 ve son zamanlarda sınırlı sayıda insan dokusunun görüntülenmesi için doku temizleme yaklaşımları geliştirilmiştir 24 . Doku temizleme için mevcut yöntemler üç aileye ayrılmıştır: (1) DISCO protokolleri 25,26 gibi organik çözücü bazlı yöntemler, (2) CLARITY27 gibi hidrojel bazlı yöntemler ve CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) gibi sulu yöntemler18,19,28,29 . CUBIC protokolleri, endojen olarak eksprese edilen muhabir proteinlerinin floresansını koruyarak organ şeklini ve doku bütünlüğünü korur. Bu tekniğin en son güncellemesi olan CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), floresan etiketli antikorlar ve DNA etiketleme28 kullanılarak epitopların tespit edilmesine de izin verir.
Bu protokolde, berraklaştırılmış bozulmamış fare dokularında floresan proteinleri eksprese eden T. cruzi’yi tespit etmek için CUBIC boru hattı kullanılmıştır. Optik olarak şeffaf dokular LSFM ile görüntülendi, 3D rekonstrükte edildi ve T. cruzi ile enfekte olmuş hücrelerin, uykudaki amastigotların ve organ başına T hücrelerinin kesin toplam sayısı otomatik olarak ölçüldü. Ayrıca, bu protokol, temizlenmiş organların antikorlar ve nükleer lekelerle tek tip etiketlenmesini sağlamak için başarıyla kabul edildi. Bu yaklaşımlar, enfekte konakçılarda T. cruzi’nin genişlemesini ve kontrolünü anlamak için gereklidir ve Chagas hastalığı için kemo- ve immüno-terapötiklerin tam olarak değerlendirilmesinde yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parazitlerin ve immün yanıtın yaygın, tüm organ görüntülemesinin olmaması, konakçı-parazit etkileşimlerinin karmaşıklığının anlaşılmasını sınırlar ve Chagas hastalığı için tedavilerin değerlendirilmesini engeller. Bu çalışma, T. cruzi ile enfekte olmuş farelerin bozulmamış organlarını ve dokularını açıklığa kavuşturmak ve boyamak için CUBIC boru hattını benimsemiştir.
Bu çalışmada çoklu doku temizleme protokolleri test edilmiştir (P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Etsuo Susaki’ye doku temizleme ve immün boyama protokolleri ile ilgili değerli yardımları ve önerileri için teşekkür ederiz. Ayrıca, LSFM ve konfokal görüntüleme kullanarak teknik destek için CTEGD Biyomedikal Mikroskopi Çekirdeğinden M. Kandasamy’ye minnettarız. Ayrıca Tarleton Araştırma Grubu’nun tüm üyelerine bu çalışma boyunca yararlı öneriler için teşekkür ederiz.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
