Imagem 3D quantitativa de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes dormentes e células T em órgãos esclarecidos intactos
Summary
O presente protocolo descreve microscopia fluorescente de folha de luz e métodos automatizados assistidos por software para visualizar e quantificar precisamente parasitas Trypanosoma cruzi e células T intactos e limpos. Essas técnicas fornecem uma maneira confiável de avaliar os resultados do tratamento e oferecem novas percepções sobre as interações parasita-host.
Abstract
A doença de Chagas é uma patologia negligenciada que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente na América Latina. O agente da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é um parasita intracelular obrigatório com uma biologia diversificada que infecta várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, causando patologias cardíacas e digestivas. A detecção confiável de infecções in vivo de T. cruzi há muito tempo é necessária para entender a biologia complexa da doença de Chagas e avaliar com precisão o resultado dos regimes de tratamento. O protocolo atual demonstra um pipeline integrado para quantificação automatizada de células infectadas por T. cruzi em órgãos limpos em 3D. A microscopia fluorescente de folha de luz permite visualizar e quantificar com precisão parasitas T. cruzi e células de efeito imunológico em órgãos ou tecidos inteiros. Além disso, o gasoduto CUBIC-HistoVision para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares foi adotado com sucesso. A limpeza tecidual aliada à imunostaining 3D fornece uma abordagem imparcial para avaliar de forma abrangente os protocolos de tratamento de drogas, melhorar a compreensão da organização celular dos tecidos infectados por T. cruzi, e espera-se que avancem descobertas relacionadas às respostas imunes anti-T. cruzi , danos teciduais e reparação na doença de Chagas.
Introduction
A doença de Chagas, causada pelo parasita protozoário T. cruzi, está entre as doenças tropicais mais negligenciadas do mundo, causando aproximadamente 13.000 mortes anuais. A infecção muitas vezes progride de um estágio agudo para um estágio crônico produzindo patologia cardíaca em 30% dos pacientes, incluindo arritmias, insuficiência cardíaca e morte súbita 1,2. Apesar da forte resposta imune hospedeira provocada contra o parasita durante a fase aguda, o baixo número de parasitas cronicamente persiste ao longo da vida do hospedeiro em tecidos como o coração e o músculo esquelético. Vários fatores, incluindo o início atrasado das respostas imunes adaptativas e a presença de formas não replicantes do parasita, podem contribuir para a capacidade de T. cruzi para evitar uma eliminação completa pelo sistema imunológico 3,4,5,6. Além disso, as formas dormentes não replicadas do parasita apresentam baixa suscetibilidade aos fármacos trypanocidas e podem, em parte, ser responsáveis pela falha de tratamento observada em muitos casos 7,8.
O desenvolvimento de novas técnicas de imagem proporciona uma oportunidade de obter uma visão sobre a distribuição espacial dos parasitas nos tecidos infectados e sua relação com as células imunes envolvidas em seu controle. Essas características são cruciais para uma melhor compreensão dos processos de controle de parasitas pelo sistema imunológico e rastreamento dos raros parasitas dormentes presentes nos tecidos crônicos.
A microscopia de fluorescência de folhas de luz (LSFM) é um dos métodos mais abrangentes e imparcial para imagens 3D de grandes tecidos ou órgãos sem secção fina. Microscópios de folha de luz utilizam uma fina folha de luz para apenas excitar os fluoroforos no plano focal, reduzir o fotobleaching e a fototoxicidade das amostras, e gravar imagens de milhares de camadas de tecido usando câmeras ultrarrápidas. O alto nível de transparência tecidual necessário para a penetração adequada da luz laser nos tecidos é obtido pela homogeneização do índice de refração (RI) após a delipidação e descoloração do tecido, o que reduz a dispersão da luz e torna imagens de alta qualidade 9,10,11.
Abordagens de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para a imagem de camundongos inteiros 12,13,14, organoides 15,16,17, órgãos expressando marcadores fluorescentes repórteres 18,19,20,21,22,23, e recentemente um número limitado de tecidos humanos24 . Os métodos atuais de limpeza tecidual são classificados em três famílias: (1) métodos orgânicos à base de solventes, como os protocolos DISCO 25,26, (2) métodos à base de hidrogel, como CLARITY27, e métodos aquosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)18,19,28,29 . Os protocolos CÚBICOS mantêm a forma dos órgãos e a integridade dos tecidos, preservando a fluorescência das proteínas de repórteres expressas endógenamente. A atualização mais recente desta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), também permite a detecção de epítopos usando anticorpos fluorescentes e rotulagem de DNA28.
No presente protocolo, utilizou-se o pipeline CUBIC para detecção de T. cruzi expressando proteínas fluorescentes em tecidos de camundongos intactos esclarecidos. Os tecidos opticamente transparentes foram imagens LSFM, reconstruídas em 3D, e o número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes dormentes e células T por órgão foram automaticamente quantificados. Além disso, este protocolo foi adotado com sucesso para obter rotulagem uniforme de órgãos limpos com anticorpos e manchas nucleares. Essas abordagens são essenciais para a compreensão da expansão e controle de T. cruzi em hospedeiros infectados e são úteis para avaliar plenamente a quimioterapia e a imunoterapia para a doença de Chagas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ausência de imagens extensas e de órgãos inteiros de parasitas e a resposta imune limita a compreensão da complexidade das interações hospedeiro-parasita e impede a avaliação das terapias para a doença de Chagas. O presente estudo adotou o gasoduto CUBIC para esclarecer e manchar órgãos e tecidos intactos de camundongos infectados por T. cruzi.
Vários protocolos de limpeza de tecidos foram testados neste estudo (PACT32, ECi33</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Etsuo Susaki por sua valiosa ajuda e recomendações sobre protocolos de limpeza de tecidos e imunossuagem. Além disso, somos gratos a M. Kandasamy do CtEGD Biomedical Microscopy Core por suporte técnico usando LSFM e imagem confocal. Agradecemos também a todos os membros do Tarleton Research Group por sugestões úteis ao longo deste estudo.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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