Summary

ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और बरकरार स्पष्ट अंगों में टी कोशिकाओं की मात्रात्मक 3 डी इमेजिंग

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और स्वचालित सॉफ्टवेयर सहायता प्राप्त तरीकों का वर्णन करता है ताकि बरकरार, साफ अंगों और ऊतकों में प्रसार और निष्क्रिय ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी और टी कोशिकाओं की कल्पना और सटीक मात्रा निर्धारित की जा सके। ये तकनीकें उपचार के परिणामों का मूल्यांकन करने और परजीवी-मेजबान इंटरैक्शन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करती हैं।

Abstract

चगास रोग एक उपेक्षित विकृति है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करती है, मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका में। चागास रोग एजेंट, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी), एक विविध जीव विज्ञान के साथ एक अनिवार्य इंट्रासेल्युलर परजीवी है जो मनुष्यों सहित कई स्तनधारी प्रजातियों को संक्रमित करता है, जिससे हृदय और पाचन विकृति होती है। विवो संक्रमण में टी क्रूज़ी का विश्वसनीय पता लगाने के लिए लंबे समय से चागास रोग के जटिल जीव विज्ञान को समझने और उपचार आहार के परिणाम का सटीक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल 3 डी-पुनर्निर्माण, साफ अंगों में टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए एक एकीकृत पाइपलाइन प्रदर्शित करता है। लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पूरे अंगों या ऊतकों में सक्रिय रूप से प्रसार और निष्क्रिय टी क्रूज़ी परजीवी और प्रतिरक्षा प्रभावकारी कोशिकाओं की सटीक कल्पना और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ किए गए अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए क्यूबिक-हिस्टोविजन पाइपलाइन को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग के साथ मिलकर ऊतक समाशोधन दवा उपचार प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने, टी क्रूज़ी-संक्रमित ऊतकों के सेलुलर संगठन की समझ में सुधार करने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है, और एंटी-टी क्रूज़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, ऊतक क्षति और चागास रोग में मरम्मत से संबंधित खोजों को आगे बढ़ाने की उम्मीद है।

Introduction

प्रोटोजोआ परजीवी टी क्रूज़ी के कारण होने वाली चगास बीमारी, दुनिया की सबसे उपेक्षित उष्णकटिबंधीय बीमारियों में से एक है, जिससे लगभग 13,000 वार्षिक मौतें होती हैं। संक्रमण अक्सर अतालता, दिल की विफलता और अचानक मृत्यु 1,2 सहित 30% रोगियों में कार्डियक पैथोलॉजी का उत्पादन करने वाले एक तीव्र से पुरानी अवस्था में आगे बढ़ता है। तीव्र चरण के दौरान परजीवी के खिलाफ मजबूत मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बावजूद, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों जैसे ऊतकों में मेजबान के जीवन भर में परजीवी की कम संख्या बनी रहती है। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की देरी से शुरुआत और परजीवी के गैर-प्रतिकृति रूपों की उपस्थिति सहित कई कारक, प्रतिरक्षा प्रणाली 3,4,5,6 द्वारा पूर्ण उन्मूलन से बचने के लिए टी क्रूज़ी की क्षमता में योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, परजीवी के गैर-प्रतिकृति निष्क्रिय रूप ट्रिपैनोसिडल दवाओं के लिए कम संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं और कई मामलों में देखी गई उपचार विफलता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं 7,8.

नई इमेजिंग तकनीकों का विकास संक्रमित ऊतकों में परजीवी के स्थानिक वितरण और उनके नियंत्रण में शामिल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनके संबंधों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। ये विशेषताएं प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा परजीवी नियंत्रण की प्रक्रियाओं की बेहतर समझ और पुराने ऊतकों में मौजूद दुर्लभ निष्क्रिय परजीवियों को ट्रैक करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) पतले-सेक्शनिंग के बिना बड़े ऊतकों या अंगों की 3 डी इमेजिंग के लिए सबसे व्यापक और निष्पक्ष तरीकों में से एक है। लाइट-शीट माइक्रोस्कोप केवल फोकल प्लेन में फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करने, नमूनों की फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने और अल्ट्रा-फास्ट कैमरों का उपयोग करके हजारों ऊतक परतों की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रकाश की एक पतली शीट का उपयोग करते हैं। ऊतकों में लेजर प्रकाश के उचित प्रवेश के लिए आवश्यक ऊतक पारदर्शिता का उच्च स्तर ऊतक डिलिपिडेशन और डिकोलराइजेशन के बाद अपवर्तक सूचकांक (आरआई) को समरूप करके प्राप्त किया जाता है, जो प्रकाश के बिखरने को कम करता है और उच्च गुणवत्ता वाली छवियोंको 9,10,11 प्रदान करता है।

पूरे चूहों की इमेजिंग के लिए ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं 12,13,14, ऑर्गेनोइड 15,16,17, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले अंग 18,19,20,21,22,23, और हाल ही में मानव ऊतकों की सीमित संख्या24 . ऊतक समाशोधन के लिए वर्तमान तरीकों को तीन परिवारों में वर्गीकृत किया गया है: (1) कार्बनिक विलायक-आधारित विधियां जैसे डिस्को प्रोटोकॉल 25,26, (2) हाइड्रोगेल-आधारित विधियां, जैसे स्पष्टता 27, और जलीय विधियां, जैसे क्यूबिक (स्पष्ट, निर्बाध मस्तिष्क / . क्यूबिक प्रोटोकॉल अंग आकार और ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं, अंतर्जात रूप से व्यक्त रिपोर्टर प्रोटीन के प्रतिदीप्ति को संरक्षित करते हैं। इस तकनीक का सबसे हालिया अद्यतन, क्यूबिक-हिस्टोविजन (क्यूबिक-एचवी), फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए एंटीबॉडी और डीएनए लेबलिंग28 का उपयोग करके एपिटोप्स का पता लगाने की भी अनुमति देता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, स्पष्ट बरकरार माउस ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त टी क्रूजी का पता लगाने के लिए क्यूबिक पाइपलाइन का उपयोग किया गया था। ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतकों को एलएसएफएम इमेज किया गया था, 3 डी का पुनर्निर्माण किया गया था, और टी क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और टी कोशिकाओं की सटीक कुल संख्या प्रति अंग स्वचालित रूप से मात्रा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। ये दृष्टिकोण संक्रमित मेजबानों में टी क्रूज़ी के विस्तार और नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक हैं और चगास रोग के लिए कीमो- और इम्यूनो-थेरेप्यूटिक्स के पूरी तरह से मूल्यांकन के लिए उपयोगी हैं।

Protocol

यह अध्ययन प्रयोगशाला पशुओं की मानवीय देखभाल और उपयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति और प्रयोगशाला पशु देखभाल प्रत्यायन दिशानिर्देशों के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के अनुसार सख्ती से …

Representative Results

क्यूबिक फिक्स्ड ऊतकों को फिक्सेटिव को हटाने के लिए पीबीएस के साथ धोया गया था और फिर क्यूबिक-एल कॉकटेल के साथ ऊष्मायन किया गया था, अमीनो अल्कोहल का एक बुनियादी बफर समाधान जो ऊतक से पिगमेंट और लिपिड निकाल…

Discussion

परजीवी के व्यापक, पूरे अंग इमेजिंग की अनुपस्थिति और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन की जटिलता की समझ को सीमित करती है और चगास रोग के लिए उपचार के मूल्यांकन में बाधा डालती है। वर्तमान अ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम ऊतक-समाशोधन और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के बारे में उनकी मूल्यवान सहायता और सिफारिशों के लिए डॉ एत्सुओ सुसाकी को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम एलएसएफएम और कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके तकनीकी सहायता के लिए सीटीईजीडी बायोमेडिकल माइक्रोस्कोपी कोर से एम कंडासामी के आभारी हैं। हम इस अध्ययन के दौरान उपयोगी सुझावों के लिए टारलटन रिसर्च ग्रुप के सभी सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

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