Investigando a patogênese da mutação MYH7 Gly823Glu em cardiomiopatia hipertrófica familiar usando um modelo de camundongo
Summary
Com base na família de cardiomiopatia hereditária familiar encontrada em nosso trabalho clínico, criamos um modelo de camundongo C57BL / 6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo através da engenharia genômica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar essa mutação.
Abstract
A cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China. No entanto, a etiologia genética subjacente da CMH permanece indescritível.
Identificamos anteriormente uma variante heterozigótica do gene da cadeia pesada 7 da miosina (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), em uma grande família Han chinesa com CMH. Nesta família, a variante G823E cosegrega com um distúrbio autossômico dominante. Esta variante está localizada no domínio do braço de alavanca da região do pescoço da proteína MYH7 e é altamente conservada entre miosinas homólogas e espécies. Para verificar a patogenicidade da variante G823E, produzimos um modelo de camundongo C57BL/6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo com engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9. Projetamos vetores de gRNA direcionados e oligonucleotídeos doadores (com sequências de segmentação ladeadas por 134 pb de homologia). O sítio p.G823E (GGG a GAG) no oligonucleotídeo doador foi introduzido no éxon 23 do MYH7 por reparo direcionado por homologia. Um p.R819 silenciado (AGG para CGA) também foi inserido para evitar a ligação do gRNA e a reclivagem da sequência após o reparo direcionado por homologia. O ecocardiograma revelou hipertrofia da parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) com sístole em camundongos MYH7 G823E/- aos 2 meses de idade. Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3).
Estes resultados demonstram que a variante G823E desempenha um papel importante na patogênese da CMH. Nossos achados enriquecem o espectro de variantes do MYH7 ligadas à CMH familiar e podem fornecer orientação para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal nesta família chinesa.
Introduction
A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas 1,2.
A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular3. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratamento médico, transplante cardíaco, equipamentos de suporte à vida e acompanhamento multidisciplinar4.
No século passado, a tecnologia de PCR mudou a maneira como estudamos o DNA5. Um método de sequenciamento de DNA para diagnóstico clínico foi descoberto por Sanger e colegas6. A técnica de Sanger foi posteriormente aplicada ao Projeto Genoma Humano, mas essa abordagem foi dispendiosa e demorada7. O advento do sequenciamento do genoma completo (WGS) trouxe insights sobre doenças genéticas humanas a novos patamares, mas permaneceu proibitivo em termos de custo. A tecnologia de sequenciamento de exoma completo (WES) tem sido usada há muito tempo para detectar variantes da linha germinativa8 e tem sido bem-sucedida na identificação de mutações de drivers somáticos no exoma de vários tipos de câncer9. A detecção de éxons de DNA ou regiões codificadoras por WES pode ser usada para revelar variantes patogênicas na maioria das doenças mendelianas. Hoje, com a diminuição do custo do sequenciamento, espera-se que o WGS se torne uma ferramenta importante na pesquisa genômica e possa ser amplamente utilizado na detecção de variantes patogênicas no genoma.
A tecnologia WES também tem sido usada na cardiomiopatia hereditária para identificar variantes patogênicas para elucidar ainda mais a etiologia. Evidências emergentes implicaram que genes que codificam mutações genéticas de proteínas estruturais do sarcômero, como MYH7 10, MYH611, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 eTPM1 18 são responsáveis pela etiologia genética da CMH. O conhecimento de variantes patogênicas em genes causadores de doenças raras (por exemplo, obscurina, calmodulina citoesquelética e RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, agindo alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 e proteína rica em cisteína e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) também tem sido associada à CMH. Estudos genéticos atuais identificaram múltiplas variantes patogênicas distintas no gene da proteína sarcomérica em aproximadamente 40%-60% dos pacientes com CMH, e testes genéticos em pacientes com CMH revelaram que a maioria das variantes patogênicas ocorre na cadeia pesada da miosina (MYH7) e na proteína C de ligação à miosina (MYBPC3). No entanto, a base genética para a CMH permanece indescritível. Explorar a patogenicidade dessas variações subjacentes aos pacientes humanos com CMH continua sendo um grande desafio22.
Neste estudo, relatamos uma variante patogênica no MYH7 em uma família Han chinesa com CMH por WES. Para verificar a patogenicidade dessa variante, estabelecemos um camundongo knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Também discutimos mecanismos plausíveis dessa variante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, descrevemos uma família Han chinesa com CMH. A análise genética revelou que uma mutação heterozigótica MYH6 p.G823E co-segrega com a doença em membros da família com herança autossômica dominante. Para validar a patogenicidade da mutação G823E e discutir os mecanismos subjacentes, criamos um modelo de camundongo C57BL/6N com G823E no locus Myh7 do camundongo por engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9.
As características fenotípicas de camundongos knockin C57BL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do Fundo de Pesquisa Médica da Província de Guangdong (A2022363) e pelo grande projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Guangdong, China (subvenção no.2022).
Gostaríamos de agradecer a Qingjian Chen, da Universidade de Maryland, College Park, pela ajuda durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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