Исследование патогенеза мутации MYH7 Gly823Glu при семейной гипертрофической кардиомиопатии с использованием мышиной модели
Summary
Основываясь на семействе семейных наследственных кардиомиопатий, найденных в нашей клинической работе, мы создали модель мыши C57BL / 6N с точечной мутацией (G823E) в локусе MYH7 мыши с помощью CRISPR / Cas9-опосредованной геномной инженерии для проверки этой мутации.
Abstract
Семейная гипертрофическая кардиомиопатия (HCM, OMIM: 613690) является наиболее распространенной кардиомиопатией в Китае. Тем не менее, основная генетическая этиология HCM остается неуловимой.
Ранее мы идентифицировали гетерозиготный вариант гена миозина тяжелой цепи 7 (MYH7), NM_000257,4: c.G2468A (p.G823E), в большой китайской семье Хань с HCM. В этом семействе вариант G823E косерегируется с аутосомно-доминантным расстройством. Этот вариант расположен в рычажной области шеи белка MYH7 и высоко сохраняется среди гомологичных миозинов и видов. Чтобы проверить патогенность варианта G823E, мы создали модель мыши C57BL/6N с точечной мутацией (G823E) в локусе MYH7 мыши с помощью CRISPR/Cas9-опосредованной геномной инженерии. Мы разработали векторы гРНК, нацеленные на донорские олигонуклеотиды (с последовательностями нацеливания, окруженными 134 bp гомологии). Сайт p.G823E (от GGG до GAG) в донорском олигонуклеотиде был введен в экзон 23 MYH7 путем гомологического репарации. Также был вставлен глушенный p.R819 (от AGG до CGA), чтобы предотвратить связывание гРНК и повторное расщепление последовательности после гомологического репарации. Эхокардиография выявила гипертрофию задней стенки левого желудочка (LVPW) с систолой у мышей MYH7 G823E/- в возрасте 2 месяцев. Эти результаты были также подтверждены гистологическим анализом (рисунок 3).
Эти результаты демонстрируют, что вариант G823E играет важную роль в патогенезе ГКМП. Наши результаты обогащают спектр вариантов MYH7, связанных с семейным HCM, и могут служить руководством для генетического консультирования и пренатальной диагностики в этой китайской семье.
Introduction
Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM, OMIM: 613690) является наиболее распространенной кардиомиопатией в Китае, с оценочной заболеваемостью 0,2%, затрагивающей 150 000 человек 1,2.
Патологической анатомической особенностью, характеризующей ГКМП, является асимметричная желудочковая гипертрофия, которая часто включает желудочковый отток и/или межжелудочковую перегородку3. Клиническим проявлением является одышка при физической нагрузке, усталость и боль в груди. Индивидуальный фенотип ГКМП имеет вариабельность, варьирующуюся от клинически коварной до тяжелой сердечной недостаточности. Пациенты с ГКМП нуждаются в медицинском лечении, трансплантации сердца, оборудовании для жизнеобеспечения и междисциплинарном наблюдении4.
В прошлом веке технология ПЦР изменила способ изучения ДНК5. Метод секвенирования ДНК для клинической диагностики был открыт Сэнгером и его коллегами6. Метод Сэнгера был впоследствии применен к проекту «Геном человека», но этот подход был дорогостоящим и трудоемким7. Появление секвенирования всего генома (WGS) вывело понимание генетических заболеваний человека на новые высоты, но оно оставалось непомерно высоким с точки зрения стоимости. Технология секвенирования цельного экзома (WES) уже давно используется для обнаружения вариантов зародышевой линии8 и успешно идентифицирует мутации соматического драйвера в экзоме различных видов рака9. Обнаружение экзонов ДНК или кодирующих областей с помощью WES может быть использовано для выявления патогенных вариантов при большинстве менделевских заболеваний. Сегодня, с уменьшением стоимости секвенирования, WGS, как ожидается, станет важным инструментом в исследованиях геномики и может широко использоваться при обнаружении патогенных вариантов в геноме.
Технология WES также использовалась при наследственной кардиомиопатии для выявления патогенных вариантов для дальнейшего выяснения этиологии. Новые данные свидетельствуют о том, что гены, кодирующие структурные мутации генов саркомера белка, такие как MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 и TPM118 , ответственны за генетическую этиологию ГКМ. Осведомленность о патогенных вариантах в редких болезнетворных генах (например, мракурин, цитоскелетный кальмодулин и титин-взаимодействующий RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, действующий альфа 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, а также цистеин и глицин богатый белок 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) также была связана с HCM. Современные генетические исследования выявили несколько различных патогенных вариантов в гене саркомерного белка примерно у 40%-60% пациентов с ГКМП, а генетическое тестирование у пациентов с ГКМП показало, что большинство патогенных вариантов встречаются в тяжелой цепи миозина (MYH7) и миозин-связывающем белке C (MYBPC3). Тем не менее, генетическая основа для HCM остается неуловимой. Изучение патогенности этих вариаций, лежащих в основе пациентов с ГКМП, остается серьезной проблемой22.
В этом исследовании мы сообщаем о патогенном варианте MYH7 в китайской ханьской семье с HCM от WES. Чтобы проверить патогенность этого варианта, мы установили нокаутирующих мышей C57BL/6N-Myh7em1(G823E) с использованием системы CRISPR/Cas9. Мы также обсуждаем правдоподобные механизмы этого варианта.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы описываем одну китайскую ханьскую семью с HCM. Генетический анализ показал, что гетерозиготная мутация MYH6 p.G823E сегрегируется с заболеванием у членов семьи с аутосомно-доминантным наследованием. Чтобы проверить патогенность мутации G823E и обсудить основные механиз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проектом Фонда медицинских исследований провинции Гуандун (A2022363) и крупным проектом Гуандунского комитета по науке и технологиям, Китай (грант No 2022).
Мы хотели бы поблагодарить Цинцзяня Чэня из Университета Мэриленда, Колледж-Парк за помощь во время подготовки этой рукописи.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
