Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ailesel Hipertrofik Kardiyomiyopatide MYH7 Mutasyonu Gly823Glu'nun Patogenezinin Bir Fare Modeli Kullanılarak İncelenmesi

Published: August 8, 2022 doi: 10.3791/63949
Automatic Translation
*1,2, *3, 4, 4, 1,2, 1,2, 1,2, 2,5, 4, 1,2
1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Klinik çalışmamızda bulunan ailesel kalıtsal kardiyomiyopati ailesine dayanarak, bu mutasyonu doğrulamak için CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği aracılığıyla fare MYH7 lokusunda bir nokta mutasyonu (G823E) olan bir C57BL / 6N fare modeli oluşturduk.

Abstract

Ailesel hipertrofik kardiyomiyopati (HCM, OMIM: 613690) Çin'de en sık görülen kardiyomiyopatidir. Bununla birlikte, HCM'nin altta yatan genetik etiyolojisi belirsizliğini korumaktadır.

Daha önce HCM'li büyük bir Çin Han ailesinde NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) geninin heterozigot varyantı olan miyozin ağır zincir 7 (MYH7) genini tanımlamıştık. Bu ailede, varyant G823E otozomal dominant bir bozuklukla birlikte ayrışır. Bu varyant, MYH7 proteininin boyun bölgesinin kol kolu alanında bulunur ve homolog miyosinler ve türler arasında oldukça korunmuştur. G823E varyantının patojenitesini doğrulamak için, CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği ile fare MYH7 lokusunda bir nokta mutasyonuna (G823E) sahip bir C57BL / 6N fare modeli ürettik. Vektörleri ve donör oligonükleotidleri hedefleyen gRNA tasarladık (hedefleme dizileri 134 bp homoloji ile çevrili). Donör oligonükleotiddeki p.G823E (GGG'den GAG'ye) bölgesi, homolojiye yönelik onarım ile MYH7'nin ekzon 23'üne sokuldu. Homolojiye yönelik onarımdan sonra gRNA bağlanmasını ve sekansın yeniden bölünmesini önlemek için susturulmuş bir p.R819 (AGG'den CGA'ya) da yerleştirildi. Ekokardiyografide 2 aylıkken MYH7 G823E/- farelerde sistollü sol ventrikül arka duvar (LVPW) hipertrofisi saptandı. Bu sonuçlar da histolojik analizlerle doğrulandı (Şekil 3).

Bu sonuçlar, G823E varyantının HCM'nin patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bulgularımız, ailesel HCM ile bağlantılı MYH7 varyantlarının spektrumunu zenginleştirmekte ve bu Çinli ailede genetik danışmanlık ve doğum öncesi tanı için rehberlik sağlayabilir.

Introduction

Hipertrofik kardiyomiyopati (HCM, OMIM: 613690), Çin'de en sık görülen kardiyomiyopatidir ve tahmini insidansı %0,2 olup, 150.000 kişiyi etkilemektedir 1,2.

HCM'yi karakterize eden patolojik anatomik özellik, sıklıkla ventriküler çıkış yolunu ve / veya interventrikülerseptumu 3'ü tutan asimetrik ventriküler hipertrofidir. Klinik bulgusu eforlu nefes darlığı, yorgunluk ve göğüs ağrısıdır. HCM'nin bireysel fenotipi, klinik olarak sinsilikten ciddi kalp yetmezliğine kadar değişen değişkenliğe sahiptir. HCM'li hastalar tıbbi tedavi, kalp nakli, yaşam destek ekipmanı ve multidisipliner takipgerektirir 4.

Geçtiğimiz yüzyılda, PCR teknolojisi DNA5'i inceleme şeklimizi değiştirdi. Klinik tanı için bir DNA dizileme yöntemi Sangerve meslektaşları 6 tarafından keşfedildi. Sanger tekniği daha sonra İnsan Genomu Projesi'ne uygulandı, ancak bu yaklaşım maliyetli ve zaman alıcıydı7. Tüm genom dizilemesinin (WGS) ortaya çıkışı, insan genetik hastalığına dair içgörüleri yeni zirvelere taşıdı, ancak maliyet açısından engelleyici kaldı. Tüm ekzom dizileme (WES) teknolojisi, germline varyantları8'i tespit etmek için uzun zamandır kullanılmaktadır ve çeşitli kanserlerin ekzomundaki somatik sürücü mutasyonlarını tanımlamada başarılı olmuştur9. DNA ekzonların veya kodlama bölgelerinin WES tarafından tespiti, çoğu Mendel hastalığında patojenik varyantları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Günümüzde dizileme maliyetinin azalmasıyla birlikte, WGS'nin genomik araştırmalarda önemli bir araç haline gelmesi ve genomdaki patojenik varyantların tespitinde yaygın olarak kullanılabilmesi beklenmektedir.

WES teknolojisi, etiyolojiyi daha da aydınlatmak için patojenik varyantları tanımlamak için kalıtsal kardiyomiyopatide de kullanılmıştır. Ortaya çıkan kanıtlar, MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ve TPM1 18 gibi sarkomer yapısal protein gen mutasyonlarını kodlayan genlerin HCM'nin genetik etiyolojisinden sorumlu olduğunu göstermiştir. Nadir hastalığa neden olan genlerdeki patojenik varyantların farkındalığı (örneğin, obscurin, sitoiskeletal kalmodulin ve titin ile etkileşime giren RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, etkili alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 ve sistein ve glisin bakımından zengin protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) de HCM ile ilişkilendirilmiştir. Mevcut genetik çalışmalar, HCM hastalarının yaklaşık% 40-60'ında sarkomerik protein geninde çok sayıda farklı patojenik varyant tanımlamıştır ve HCM hastalarında yapılan genetik testler, çoğu patojenik varyantın miyozin ağır zincirinde (MYH7) ve miyozin bağlayıcı protein C'de (MYBPC3) meydana geldiğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, HCM'nin genetik temeli belirsizliğini korumaktadır. İnsan HCM hastalarının altında yatan bu varyasyonların patojenitesini araştırmak büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir22.

Bu çalışmada, WES tarafından HCM'li Çinli bir Han ailesinde MYH7'de patojenik bir varyant bildirilmiştir. Bu varyantın patojenitesini doğrulamak için, CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak bir C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin fareleri kurduk. Ayrıca bu varyantın makul mekanizmalarını da tartışıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ailelerin tarihleri, aile bireyleri ile görüşülerek elde edilmiştir. Çalışma, Guangdong İl Çin Tıbbı Hastanesi Etik Komitesi (No. 2019074) tarafından onaylanmıştır. Tüm aile bireylerinden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Tüm hayvanlar, Guangdong İl Çin Tıbbı Hastanesi'nin (Guangzhou, Çin) etik kurallarına uygun olarak tedavi edilmektedir.

1. Çalışma konuları

NOT: Sonda III-3, Temmuz 2019'da Guangdong İl Çin Tıbbı Hastanesi Kardiyovasküler Cerrahi Bölümü'nde tıbbi tavsiye aldı.

  1. Probandın ayrıntılı aile tıbbi öyküsünü alın. Probandın tüm aile üyelerini bilgilendirin ve arayın. Tüm aile bireyleri titiz fizik muayenelerden geçirilmiştir.
    1. Tıbbi kayıtlar, EKG'ler, ekokardiyogramlar ve kalp kateterizasyon raporları dahil olmak üzere tüm klinik verilerin sistematik bir incelemesini yapın.
    2. Müdahale veya ameliyat sırasında tüm hastalarda kardiyak fenotipleri yeniden doğrulayın.
  2. Yerel veritabanından toplam 174 popülasyon tabanlı sağlıklı denetim seçin. Her hastadan yaklaşık 4.0 mL periferik venöz kan toplayın.

2. DNA ekstraksiyonu

NOT: DNA, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kan kiti ile ekstrakte edilir.

  1. Lyse kan hücreleri, üreticinin protokolünü takip eden bir DNA stabilizatörü varlığında anyonik bir deterjanla yapılır.
  2. Hücre lizatına 10 μL RNaz A çözeltisi ekleyin ve tüpü 25 kez ters çevirerek karıştırın. 37 °C'de 15 dakika ila 1 saat arasında inkübe edin.
  3. Proteinleri tuz çökelterek uzaklaştırın. Proteinleri çökeltmek için protein çökeltme çözeltisi (25 mL damıtılmış suda çözünmüş 0.25 mg sığır serum albümini) ve% 100 izopropanol kullanın. Daha sonra, 200 μL% 70 etanol kullanın ve DNA peletini yıkamak için 15 dakika boyunca 4 ° C'de 12.000 x g / dak'da santrifüjleme yapın.
  4. Genomik DNA'yı 500 μL% 70 etanol ile çökelterek geri kazanın. 30 s için 12.000 x g'de santrifüj. Peletin aspire edilmesi ve ardından hidrasyon çözeltisi içinde çözülmesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7.5).
  5. Saflığı belirlemek için bir spektrofotometre (örneğin, NanoDrop 2000) kullanın. Saflaştırılmış DNA tipik olarak 1.7 ila 1.9 arasında bir A260 / A280 oranına sahiptir ve boyutu 200 kb'ye kadardır.
  6. DNA'yı 2-8, -20 veya -80 ° C'de uzun süre saklayın.

3. Tüm ekzom dizilimi ve varyant analizi

NOT: Hastalığa neden olan gen mutasyonlarını sistematik olarak araştırmak için, etkilenen bireylerde (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 ve IV-3) ve etkilenmemiş bireylerde (III-2, III-5, IV-4) ekzom dizilimi yapılmıştır.

  1. Ekzom yakalamayı gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına göre ekzom probu kullanın.
  2. Nitelikli kütüphaneleri HiSeq X-ten platformunda 2 × 150 bp çift uçlu sıralamaya uygulayın. Lütfen Ek Dosya 1'e bakın.
  3. FASTQ dosyalarını BWA v0.7.1318,19 ile insan referans genomuna (hg19/GRCh37) hizalayın. Hizalanan dosyaları (sam/bam biçimindeki dosyalar) samtools ile sıralayın ve ardından Picard'ı kullanarak kopyaları işaretleyin. Lütfen Ek Dosya 1'e bakın.
  4. GATK kullanın, okumaları yerel olarak yeniden hizalayın ve temel nitelikleri yeniden kalibre edin. Lütfen Ek Dosya 1'e bakın.
  5. BEDTools ve şirket içi perl/python betikleri tarafından yeniden kalibre edilen dosyalardan kapsama alanı ve derinliği içeren haritalama istatistikleri oluşturun.
  6. GATK'dan HaplotypeCaller aracının çok örnekli işleme modu kullanılarak yeniden kalibre edilmiş BAM dosyalarından genotip varyantları (SNV'ler ve indel'ler).
  7. Varyant çağrısının yanlış pozitiflerini azaltmak için VQSR'yi (varyant kalite puanı yeniden kalibrasyonu) kullanın.
  8. Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) ve 1.000 G (http://www.1000genomes.org) dahil olmak üzere birden fazla veritabanına karşı ANNOVAR yazılımını21 kullanarak SNV'lere ve indellere açıklama ekleyin. Sekans varyantlarının patojenitesini ACMG kılavuzlarına göre yorumlayın.

4. Sanger dizilimi

  1. Potansiyel nedensel değişkenleri doğrulamak ve ABI 3500 sıralayıcı23 kullanarak ailedeki varyant ayrımını belirlemek için Sanger dizilemesi gerçekleştirin.
  2. MYH7 genindeki varyant için astar dizileri tasarlayın (NM_000257) aşağıdaki gibi: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' ve 5'- CGGACTTCTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
  3. Bir varyasyonu onaylayın, aile 23 içindeki varyasyon ayrımını belirlemek için mevcut tüm aile üyelerinitarayın.

5. C57BL / 6N-MYH7em1 (G823E) knockin farelerin üretimi

  1. C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin fareleri oluşturmak için CRISPR/Cas9 sistemini kullanın. Fare Myh7 geni (GenBank katılım numarası: NM_001361607.1; Topluluk: ENSMUSG00000053093) fare kromozomu 14 üzerinde bulunur ve 41 ekzona sahiptir. ATG ekzon 4'te kodonu başlatır ve ekzon 41'de TAG stop kodonu ve G823E ekzon 23'te bulunur. Hedef site olarak ekzon 23'ü seçin.
  2. gRNA hedefleme vektörü ve donör oligo dizisini tasarlayın (her iki tarafta birleştirilmiş 134 bp homolog dizilerle çevrili hedefleme dizisi ile).
    1. NCBI web sitesine giriş yapın ve sağdaki BLAST çevrimiçi astar tasarım işlevine tıklayın.
    2. Astarları tasarlamak için sayfanın altındaki Primer-BLAST işlevine tıklayın.
    3. MYH7 NCBI referans sıra numarası NM_000257.4'ü PCR şablonu kutusuna yapıştırın.
    4. Hedef parçayı (MYH7 cDNA ekzon 23 ve bitişik ekzonları) yükseltin, böylece ekzon 21'de (2392-2528) yukarı akış astarı ve ekzon 25'te (3205-3350) aşağı akış astarı tasarlayın. Yukarı akış ve aşağı akış astarlarının ekzon numarasını sağ aralık kutusuna girin.
    5. Otomatik olarak birden fazla astar çifti oluşturmak için alttaki Primer'ları Al düğmesine tıklayın.
  3. MYH7 genini ZFIN veritabanına girin, donör oligonükleotiddeki p.g823e (GGG'den GAG'ye) mutasyon bölgesini ve ekzon 23'e sessiz mutasyon p.r819'u (AGG'den CGA'ya) tanıtın. Sessiz mutasyon, homolojiye yönelik onarımdan sonra dizinin gRNA ile bağlanmasını ve yeniden kesilmesini önler.
    1. Genel diziye göre gRNA'yı tasarlayın, her iki uçtaki diziler TAATACGACTCACTATA- ve -GTTTTAGAGCTA'dır. Dizinin ortası, yukarıda belirtilen hedef sitedir.
  4. Cas9 mRNA, in vitro transkripsiyon ve donör oligo tarafından üretilen gRNA'yı KI fare üretimi için döllenmiş yumurtalara birlikte enjekte edin.
    1. Tasarlanan gRNA hedefini in vitro olarak gRNA'ya aktarmak ve transkriptin aktivitesini tespit etmek için Cas9/gRNA hedef verimliliği tespit kitini kullanın (spesifik tespit yöntemleri için VK007 kiti talimatlarına bakın) üreticinin protokolüne göre.
    2. T7 ARCA mRNA kiti bileşenlerini çözün, tüplerin diplerine çözeltiler toplamak için bir mikrofüjde karıştırın ve nabız dönüşü yapın. Reaksiyonu oda sıcaklığında aşağıdaki sırayla birleştirin: 10 μL'ye 2x ARCA / NTP karışımı, 1 μg şablon DNA, 2 μL T7 RNA polimeraz karışımı ve nükleaz içermeyen su 20 μL'ye.
    3. İyice karıştırın ve bir mikrofüjde nabız dönüşü yapın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. 2 μL DNaz I ekleyerek şablon DNA'yı çıkarın, iyice karıştırın ve mRNA elde etmek için 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    5. Serum gonadotropin ve insan koryonik gonadotropininin intraperitoneal enjeksiyonunu, yaklaşık 4 haftalıkken önceden hazırlanmış C57BL / 6 dişi farelere, fare başına yaklaşık 5 U'luk bir dozda 0.5 mL'lik bir şırınga ile 48 saatlik iki enjeksiyon arasında bir aralıkla gerçekleştirin.
    6. Dozlamadan on sekiz saat sonra, hormon enjeksiyonundan sonra servikal çıkık ile C57BL / 6 dişi fareyi ve bir 8-12 haftalık C57BL / 6 erkek fareyi kurban edin. Yumurtaları ve spermleri ayrı ayrı toplayın.
    7. Sperm, kapasitasyon sıvısında kapasite edilir. Sıvının kenarındaki spermleri alın ve 3-4 saat boyunca in vitro fertilizasyon için kısa ömürlü yumurta hücrelerine bırakın.
    8. Başarılı bir şekilde transkribe edilmiş gRNA ve Cas9 mRNA'yı in vitro olarak RNaz içermeyen suyla 25 ng / μL ve 50 ng / μL'ye seyreltin. Döllenmiş yumurtaları dişi farelerin genişlemiş yumurta kanalına iyi durumda nakledin. Bağlı erkek fareler ile ortak kafes.
  5. Yavruları PCR ile genotiplendirin. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 3 dakika boyunca 94 °C, 30 s için 94 °C'lik 35 döngü, 35 s için 60 °C ve 35 s için 72 °C; 5 dk için 72 °C Dizi analizi ile takip edin.
    1. 4 aylık farelerin kuyruklarını makasla kesin ve 1,5 mL EP tüpe yerleştirin. Bir mikrosantrifüj tüpüne kuyruk parçası başına 180 μL Buffer GL, 20 μL Proteinaz K ve 10 μL RNaz A ekleyin. Çok fazla kuyruk kesmemeye dikkat edin.
    2. Tüpü gece boyunca 56 ° C'de inkübe edin.
    3. Safsızlıkları gidermek için 1.000 x g'de bir mikrosantrifüj tüpünde 2 dakika boyunca döndürün.
    4. Yeterli karıştırma ile 200 μL Tampon GB ve 200 μL mutlak etil alkol ekleyin.
    5. Döndürme sütununu bir toplama tüpüne yerleştirin. Numuneyi 2 dakika boyunca 1.000 x g'de spin ve santrifüje uygulayın. Akış akışını atın.
    6. Döndürme kolonuna 500 μL Tampon WA ekleyin ve 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
    7. Döndürme kolonuna 700 μL Buffer WB ekleyin ve 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. Akış akışını atın.
      NOT: Buffer WB'nin %100 etanol ile önceden karıştırıldığından emin olun. Tampon WB eklerken, kalan tuzu yıkamak için tüp duvarına ekleyin.
    8. Adım 5.5.7'yi yineleyin.
    9. Sıkma kolonunu bir toplama tüpüne yerleştirin ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.
    10. Döndürme kolonunu yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Kolon membranının ortasına 50-200 μL sterilize su veya elüsyon tamponu ekleyin ve kolonun 5 dakika bekletin.
      NOT: Isıtma sterilize su veya elüsyon tamponunun 65 °C'ye kadar ısıtılması, elüsyon verimini artırabilir.
    11. DNA'yı ortaya çıkarmak için, sütunu 2 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. DNA verimini artırmak için, spin kolon membranının merkezine akış ve / veya 50-200 μL sterilize su veya elüsyon tamponu ekleyin ve sütunun 5 dakika beklemesine izin verin. 2 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj.
    12. Salınan genomik DNA'yı elektroforez ile sayısallaştırın.

6. Kardiyak morfoloji ve fonksiyonun değerlendirilmesi

NOT: C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin farelerinin kalp morfolojisini ve fonksiyonunu değerlendirmek için M-mod ekokardiyografi uygulayın.

  1. Knockin farelerini anestezi makinesine bağlı kapalı bir akrilik kutuya koyun ve izofluran'ın (konsantrasyon: % 3) akrilik kutuya akmasına izin vermek için üç yönlü arayüzü ayarlayın. Knockin fareleri özerk olarak hareket etmeyi bıraktıktan sonra, knockin farelerini çıkarın.
  2. Knockin farelerini küçük hayvan anestezi makinesinin yaşam izleme platformuna düz bir şekilde yerleştirin ve oksijen (akış: 0.8 L / dak) ve izofluran (konsantrasyon: % 3) ile karıştırılmış sürekli inhalasyon anestezisi. Korneanın kurumasını önlemek için anestezi uygulanan farelere göz yağlayıcısı uygulayın.
  3. Knockin farelerini platformda yatay olarak sabitleyin. Platformu 30° kaudal olarak knockin mouse'a eğin. Tüy dökücü bir krem kullanarak vurucu farenin ön göğüs duvarındaki tüyleri çıkarın.
  4. Probu, yumru hayvanın kafasına bakacak şekilde dikey olarak konumlandırın. Ardından, probu saat yönünün tersine, yaklaşık 45° döndürün.
  5. Parasternal uzun eksen görünümünde, parasternal kısa eksen görünümünü gözlemlemek için probu saat yönünde 90° döndürün. Probu 90° döndürdükten sonra, doğru dilimi elde etmek için y ekseni yer değiştirmesini ayarlayın.
  6. Kalbin uzun eksenli görüntüsünü gözlemleyin (Şekil 1C) ve ardından M modu ölçüm verilerini seçin.
  7. Farelerin parasternal uzun eksenli görünümlerinden ultrason verileri elde edin (Şekil 1). Kalp hızı (HR), sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF), kardiyak çıkış (CO), Sol ventrikül diyastolik sonu boyutu (LVDd), LVD'lerin sol ventrikül sonu sistolik boyutu (LVSd), interventriküler septum (IVS) ve sol ventrikül arka duvarı (LVPW) ölçülür.
  8. Ölçümden sonra, farelere oksijen verin ve özerk aktiviteyi yeniden kazandıklarında onları kendi kafeslerine geri yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ailelerin klinik profili
HCM'nin aile soyağacı elde edilmiş ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Belgelenen tüm aile üyelerine kayıt sırasında HCM teşhisi kondu.

Ailede (Şekil 2A) sonda, 46 yaşında HCM ve sol ventrikül çıkış yolu obstrüksiyonu (LVOTO) tanısı alan ve kalp cerrahisi uygulanan III-7 numaralı hastaydı. Hasta III-3'te cerrahi tedavi gerektirmeyen minör HCM mevcuttu. Hasta IV-3'te ayrıca babası Hasta III-3'e benzeyen küçük HCM vardı. Hasta II-5'te HCM vardı ve LVOTO nedeniyle 51 yaşında defekti onarmak için ameliyat edildi. Hasta I-1 ve hasta II-2 sırasıyla 57 ve 46 yaşında kalp kazaları nedeniyle öldü. Hasta I-1'in tıbbi öyküsü kullanılamıyordu. Hasta II-7 ve hasta III-9 nefes darlığı ile başvurdu ve HCM tanısı aldı.

Ekzom dizisi analizi ve varyantların ayrılması
Bu ailede, beş bireyin ekzom dizilimi, ortalama 125 bp okuma uzunluğuna sahip toplam 19.978.731 çift sıralı okuma üretti. Toplamda, sıralanmış okumaların% 98.72'si kalite değerlendirmesini geçti ve insan referans genomunun% 98.66'sına eşlendi. Filtrelemeden sonra bile, bu dört hasta tarafından 42'den fazla varyant (tek nükleotid ikameleri ve indeller dahil) paylaşıldı. Bunlardan 27'si yanlış SNV'lerdi, 15'inin eklemeyi değiştireceği tahmin ediliyordu. Son olarak, ACMG derecelendirme kılavuzlarına göre, heterozigot bir c.G2468A; MYH7'nin p.G823E varyantı (NM_0002571) prob III-7'de ve diğer üç hastada gözlendi.

Patojenik mutasyonun tanımlanması
Sanger dizilimi, tüm hastalarda aynı MYH7 p.G823E varyantını doğruladı, ancak ailelerdeki sağlıklı bireylerde ve 174 kontrolde değil (Şekil 2B). Heterozigot MYH7 p.G823E bu ailede tamamen birlikte ayrılmıştır. Bu ailede, bu varyantı barındıran IV-3 hastaları, hasta III-3'ten miras kalmıştır. III-7 ve III-8 hastaları, babalarından miras kalan aynı varyantı taşıyorlardı. Hasta III-9 için bilgi mevcut değildi.

HCM'de daha önce sporadik bir hasta24 tarafından tanımlanan bu varyant, 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar veritabanlarında veya kontrol deneklerinde bildirilmemiştir. MYH7'nin boyun etki alanı bölgesindeki kodon 823'teki glisin kalıntısı, mevcut tüm omurgalı miyozin dizilerinde yüksek oranda korunmuştur (Şekil 2C). MYH7 bilinen bir HCM-nedensel gendir ve kardiyak gelişim veya yapı / fonksiyonda önemli bir rol oynar. ACMG standartlarına ve yönergelerine dayanarak, MYH7 p.G823E varyantının patojenik bir varyant (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2) olduğu tahmin edildi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar bu varyantın zararlı olduğunu ve bu ailelerde HCM'nin patogenezine katkıda bulunduğunu desteklemektedir.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin farelerde ciddi kardiyak hipertrofi gelişti
MYH7 p.G823E'nin patogenezini daha fazla doğrulamak için C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin fareleri üretiyoruz. C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockin farelerde doğumdan sonra yaşa bağlı kardiyak hipertrofi gelişti (Şekil 2A,B). Ekokardiyografide IVS ve LVPW'nin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin farelerde artmış HR ile geliştiği saptandı (Tablo 1). Bu sonuçlar da histolojik analizlerle doğrulandı (Şekil 3). Vahşi tip ve heterozigot fareler arasında LVDd, LVD, EF veya CO'da belirgin bir fark yoktu (Tablo 1).

Figure 1
Şekil 1: Ultrason veri toplama . (A) Prob, sternumun uzun ekseninde bulunur. (B) Prob, sternumun kısa ekseninde bulunur. (C) Sternumun uzun eksenli görünümünün M-mod ultrason görüntüsü. Sarı ok, interventriküler septumun yerini gösterir. Kırmızı ok, yüzer valfi gösterir. (D) Sternumun kısa eksenli görünümünün M modu ultrason görüntüsü. Sarı ok, ön papiller kasın yerini gösterir ve aşağıdaki çıkıntı posterior papiller kastır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Heterozigot MYH7 G823E varyantını taşıyan büyük aile . (A) Prob bir okla işaretlenmiştir. Tam ve açık daireler ve kareler sırasıyla etkilenen ve normal bireyleri gösterir. (B) MYH7'deki G823E varyantı, Sanger dizilimi ile doğrulanmıştır. (C) MYH7 G823E sahasının farklı türlerde korunması. Sarı ok, yüksek oranda korunmuş olan farklı türlerin amino asit dizisindeki G823E bölgesini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Miyokard dokusunun patolojik değişiklikleri. (A) Miyokard lifleri düzenli bir şekilde düzenlenir ve her bir parça arasında anlamlı bir fark yoktur. (B) Ventriküler kas lifi hipertrofisi, düzensiz düzenleme ve lezyonlar esas olarak sol ventrikülün arka duvarında ve interventriküler septumda yoğunlaşır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin fare grubu Kontrol grubu
(n=4) (n=6)
İK (/dak) 451,25 ± 25,786 413,83 ± 12,77 P = 0,015
LVDd (mm) 4.12 ± 0.33 3,95 ± 0,20 P = 0.330
LVD'ler (mm) 2,95 ± 0,44 2.85 ± 0.20 P = 0.626
EF(%) 55,02 ± 9,52 54,31 ± 5,11 P = 0.881
CO (mL) 18,46 ± 3,05 15,30 ± 2,39 P = 0,102
IVS (mm) 1.13 ± 0.20 0.67 ± 0.07 P = 0,001
LVPW (mm) 1.40 ± 0.60 0.70 ± 0.06 P = 0.000

Tablo 1: p.G823E ve wild tip için morfoloji ve fonksiyon analizi. Veriler SPSS kullanılarak analiz edilmiştir. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. Öğrencinin t veya Wilcoxon, sürekli değişkenler için toplam testleri sıralar. 0.05'in altındaki P-değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Ek Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, HCM'li bir Çinli Han ailesini tanımladık. Genetik analiz, heterozigot bir MYH6 mutasyonunun p.G823E'nin otozomal dominant kalıtımlı aile bireylerinde hastalıkla birlikte ayrıldığını ortaya koymuştur. G823E mutasyonunun patojenitesini doğrulamak ve altta yatan mekanizmaları tartışmak için, CRISPR / Cas9 aracılı genom mühendisliği tarafından fare Myh7 lokusunda G823E ile bir C57BL / 6N fare modeli oluşturduk.

C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockin farelerin fenotipik özellikleri ekokardiyografi ile değerlendirildi. C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin farelerinde kontrollere kıyasla çoklu trabekülasyon ve sıkıştırılmamış ila sıkıştırılmış miyokard tabakasının daha yüksek bir oranı bulundu. Transgenik fareler ayrıca LVPW ve IVS hipertrofisi ve HR'de bir artış gösterdi. Bununla birlikte, kalbin işlevi iki grup arasında anlamlı bir değişiklik göstermedi. Bu sonuçlar, artmış bir İK'nın kardiyak yeniden modelleme sırasında bakım ventrikülü fonksiyonu üzerinde telafi edici bir etki gösterebileceğini düşündürmektedir. Kalbin morfolojisini ve işlevini gözlemlemek ve analiz etmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Miyosin-7 (MYH7), miyokard sarkomerik yapısal proteinleri ailesine aittir. MYH7 geni tarafından kodlanan MYH7 (14q11.2; OMIM: 160760), 1990 yılında HCM ile ilişkili ilk patojenik gende bulunur. Bugüne kadar, MYH7 genindeki 300'den fazla varyant HCM25,26 ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, varyasyonun büyük çoğunluğunun patojenitesi belirsizliğini korumaktadır. Bu protokolü kullanarak, model fareleri başarıyla oluşturduk. Model fareyi planlarken ve tasarlarken, göz önünde bulundurulan üç ana konu vardır. İlk olarak, fare MYH7 proteininin amino asit dizisi insanla oldukça homologdur. İkincisi, MYH7 ventriküllerde ve insanlarda MYH7'de yüksek oranda eksprese edilir. MYH7'deki kodon 823'teki glisin kalıntısı, mevcut tüm miyozin dizilerinde yüksek oranda korunmuştur.

MYH7, N-terminusunda, aktin'i bağlayan ve aktinle aktive edilmiş Mg· ATPaz aktivitesi ve bir boyun bölgesinin yanı sıra C-terminusta bir sarmal bobin (CC) bölgesi içeren bir miyozin kuyruğu. MYH7'nin boyun etki alanı bölgesindeki kodon 823'teki glisin kalıntısı, bu varyasyonunkasılma 27,28,29,30'daki kol kolu rotasyonunu etkileyebileceğini düşündürmektedir.

WES esas olarak, toplam genom DNA'sının sadece% 1.5'ini% 8'ini oluşturan genlerin ekzonlara odaklanır. Bununla birlikte, tanımlanan insan genetik hastalıklarının çoğu ekzonlar31 ile ilgilidir. Bu, WES'in klinik pratikte yaygın olarak tanınmasını ve uygulanmasını sağlar. WES'in yaygın olarak uygulanmasıyla ilgili bazı etik sorunlar vardır. Bu tür insan genetik hastalıklarının incelenmesi genellikle sınır ötesi tartışmaları içerir. Araştırmacılar kişisel olarak tanımlanabilir bilgileri mümkün olduğunca kaldırmaya çalışsalar da, DNA'da bulunan büyük bilgiler hala araştırma bireylerini ve hatta ailelerini yeniden tanımlayabilir. Sadece standartlaştırılmış bilgi alışverişi önlemleri WES'in rasyonel uygulanmasını sağlayabilir. Gelecekte, WES, spesifik gen mutasyonları için tıbbi stratejiler ve çoklu hastalıklar için bireyselleştirilmiş tanı ve tedavi önlemleri için büyük önem taşımaktadır.

Özetle, WES kullanan HCM'li büyük bir Çinli Han ailesinde bir MYH7 heterozigot varyantı olan p.G823E'yi tanımladık. C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockin farelerinin vahşi tip farelerden daha kalın IVS ve LVPW'ye ve daha hızlı HR'ye sahip olduğu bulunmuştur. P.G823E varyantı kol rotasyonunu bozabilir, bu da bu mutasyonun ailesel HCM'de önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Çalışmamız, HCM ile ilişkili MYH7 geninin mutasyon spektrumu hakkındaki bilgileri genişletmekte ve etkilenen ailelerin uygun tanı ve genetik danışmanlığına daha iyi açıklık getirmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecek finansal çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Tıbbi Araştırma Fonu projesi (A2022363) ve Çin Guangdong Bilim ve Teknoloji Komitesi'nin (hibe no.2022) ana projesi tarafından desteklenmiştir.

Maryland Üniversitesi, College Park'tan Qingjian Chen'e bu yazının hazırlanması sırasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5×TBE Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus) Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose Regu
Anesthesia machine for small animals Reward Life Technology Co., Ltd. R500
BEDTools 2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. VK007
DNA Marker Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. DNAstable LD prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-S7220-B
GATK v3.5
Gentra Puregene blood kit Santa Clara
Glass slide, coverslip Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform Illumina perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane Local suppliers inhalation anesthesia
Microinjection microscope Nikon ECLIPSE Ts2
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000
Paraffin Embedding Machine Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. HS-B7126-B
Picard (2.2.4) 20
Proteinase K Merck KGaA
samtools 1.3
Sequencer Applied Biosystems ABI 3500
Stereomicroscope Nikon SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6 Agilent Technology Co., Ltd. exome probe
T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs, Inc. NEB-E2065S
Temperature box BINDER GmbH KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution Sigma, Merck KGaA No. T2663
Veterinary ultrasound system Royal Philips CX50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Tags

Genetik Sayı 186
Ailesel Hipertrofik Kardiyomiyopatide MYH7 Mutasyonu Gly823Glu'nun Patogenezinin Bir Fare Modeli Kullanılarak İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S.,… More

Xia, Y., Hu, J., Li, X., Zheng, S., Wang, G., Tan, S., Zou, Z., Ling, Q., Yang, F., Fan, X. Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (186), e63949, doi:10.3791/63949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter