במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

Abstract

מלריה היא דאגה מרכזית לבריאות הציבור, ומציגה יותר מ -200 מיליון מקרים בשנה ברחבי העולם. למרות שנים של מאמצים מדעיים, חסינות מגינה למלריה עדיין אינה מובנת, בעיקר בשל מגבלות מתודולוגיות של תרבית פלסמודיום ארוכת טווח, במיוחד עבור פלסמודיום vivax. רוב המחקרים התמקדו בהגנה על מערכת החיסון הנרכשת מפני מלריה על ידי נוגדנים, הממלאים תפקיד מפתח בשליטה במלריה. עם זאת, ההגנה הסטרילית המושרה על ידי חיסונים מוחלשים נגד פלסמודיום ספורוזואיטים קשורה לתגובה תאית, בעיקר ללימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T, כגון CD8⁺ ותאי T מסוג גמא דלתא (γδ T). לפיכך, יש לפתח מתודולוגיות חדשות כדי להבין טוב יותר את הפונקציות של התגובה החיסונית התאית ובכך לתמוך בטיפול עתידי ופיתוח חיסונים. כדי למצוא אסטרטגיה חדשה לניתוח חסינות תאית זו לזיהום פלסמודיום בשלב הדם, הקבוצה שלנו הקימה בדיקה במבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים (iRBC) על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים. בדיקה זו יכולה לשמש לחקר מנגנוני תגובה חיסונית תאית נגד פלסמודיום spp. שונים בשלב הדם. תאי חיסון ציטוטוקסיים מולדים ונרכשים יכולים לחסל ישירות iRBCs ואת הטפיל התוך-תאי במנגנון effector:target. iRBCs מטרה מסומנים כדי להעריך את כדאיות התא, ומתורבת יחד עם תאי אפקט (CD8⁺ T, γδ T, תאי NK וכו ‘). אחוז הליזה מחושב על בסיס התנאים שנבדקו, בהשוואה לבקרת ליזה ספונטנית בבדיקה מבוססת ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, מתודולוגיית בדיקת הרג זו היא התקדמות משמעותית בהבנת חסינות תאית למלריה בשלב הדם, ומסייעת לחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות ולהאיץ את הפיתוח של חיסונים נגד מלריה.

Introduction

המלריה נותרה משבר בריאותי עולמי, עם יותר מ -240 מיליון מקרים ו -627,000 מקרי מוות הקשורים למלריה שדווחו בשנת 2020¹. כיום ישנם חמישה מינים טפיליים שיכולים לגרום למלריה בבני אדם, מתוכם פלסמודיום פלציפרום ופלסמודיום ויווקס הם שני המינים הנפוצים ביותר. במהלך זיהום פלסמודיום, הכבד או השלב הפרה-אריתרוציטי הוא אסימפטומטי, והתסמינים מתרחשים רק במהלך המחזור הא-מיני של הטפיל בשלב האריתרוציטי. בשלב זיהום זה, אלפי מרוזואיטים שמקורם בשלב הכבד משתחררים לזרם הדם ומדביקים תאי דם אדומים (RBC). ב RBC, הטפילים להבדיל trophozoites ו schizonts על ידי schizogony, עד schizonts לקרוע את אריתרוציטים, שחרור merozoites שזה עתה נוצרו, חוזר על מחזור הדם הזה. מחזורים חוזרים ונשנים של פלישה, שכפול ושחרור מרוזואיטים גורמים לגידול אקספוננציאלי באוכלוסיית הטפילים ובסופו של דבר מעוררים תסמיני מחלה².

אתגר חשוב בחקר התגובה החיסונית למלריה הוא כי פלסמודיום spp. שמדביק בני אדם אינו מדביק מודלים של חיות מעבדה. לפיכך, דגימות חולים נגועים פלסמודיום חייב להיאסף טרי מיד מעובד ומנותח. עם זאת, באזורים אנדמיים למלריה, המשאבים לגישה למנגנונים אימונולוגיים ומולקולריים מוגבלים. בשל מגבלות אלה, מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים ניסיוניים כדי לחקור את התגובה החיסונית נגד זיהום פלסמודיום. בעוד P. berghei ו- P. chabaudi משמשים לעתים קרובות כפונדקאיות לזיהום P. falciparum, לזן הלא קטלני של P. yoelii 17XNL יש גם תכונות רבות במשותף עם P. vivax, כגון זיהום מוגבל רטיקולוציטים ^3,4. הפיתוח של מבחני פלסמודיום במבחנה, שניתן להשתמש בהם עבור דגימות שמקורן במודלים אנושיים או בעלי חיים, הוא בעל ערך בהשגת הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מלריה והשוואת התגובה החיסונית המתעוררת על ידי מינים שונים של הטפיל.

חסינות מגן נגד מלריה אינו מובן לחלוטין לא בשלב טרום אריתרוציטי ולא בשלב הדם. ידוע כי חשיפה לזיהומים חוזרים גורמת לחסינות נרכשת חלקית, אך חסינות סטרילית כמעט ולא מתפתחת⁵. במשך עשרות שנים, חסינות מגן נגד פלסמודיום היה קשור בעיקר עם אינדוקציה של נוגדנים מנטרלים או opsonizing המונעים פלישת טפילים של תאים מארחים או להוביל phagocytosis על ידי תאים מציגי אנטיגן, בהתאמה⁶. כתוצאה מכך, רוב המאמצים לייצר חיסונים נגד מלריה עד כה הסתמכו על השראת נוגדנים מגנים וארוכי טווח ^7,8. עם זאת, ההגנה הסטרילית המושרה על ידי חיסון עם ספורוזואיט מוחלש מתואמת ישירות עם הפעלה והרחבה של לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T ^8,9.

לאחרונה, כמה מחקרים של דגימות חולים שבודדו לאחרונה ותרביות במבחנה הוכיחו כי תאים חיסוניים ציטוטוקסיים מולדים או אדפטיביים כמו CD8⁺ T¹⁰, γδ T 11 ותאי NK¹² יכולים לחסל ישירות RBCs נגועים בפלסמודיום ואת הטפיל התוך-תאי שלו באופן של יחס אפקטור:מטרה. ממצאים ראשוניים אלה הגדירו מנגנון השפעה חיסוני חדש לחלוטין בהקשר של מלריה. כדי לנתח את החסינות החדשה הזו נגד מלריה, חיוני לחקור מנגנוני השפעה ציטוטוקסיים של תאי הרג נגד RBCs נגועים (iRBCs) בזיהום טבעי או חיסון.

כאן אנו מציגים בדיקה חוץ גופית המודדת את הפעילות ציטוטוקסית של לימפוציטים נגד מלריה בשלב הדם. בדיקה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני התגובה החיסונית התאית נגד שלב אריתרוציטים פלסמודיום . תאי המטרה, iRBCs, מסומנים ב-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) כדי להעריך את כדאיות התא, ולאחר מכן עוברים תרבית משותפת עם תאים משפיעים כמו לימפוציטים ציטוטוקסיים (CTL). תרבות משותפת זו מוערכת לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בסמנים פלואורסצנטיים עבור סוגי תאים ספציפיים. לבסוף, אחוז הליזה iRBC על ידי CTL מחושב על ידי חלוקת מצב הניסוי על ידי קרע ספונטני של RBCs ובקרת ליזה ספונטנית, המתרחשת במהלך הדגירה ללא התא המשפיע. בסך הכל, מתודולוגיית בדיקת הרג זו יכולה לתרום להבנה טובה יותר של חסינות מלריה בתיווך תאים.

Protocol

כל ההליכים נערכו בהתאם למדיניות קרן אוסוולדו קרוז והמועצה האתית הלאומית (CAAE: 59902816.7.0000.5091). הפרוטוקולים האנושיים פותחו בשיתוף פעולה עם קבוצת המחקר הקליני ממרכז המחקר לרפואה טרופית של רונדוניה (CEPEM), שהיה אחראי על רישום החולים למחקר. התקבלה הסכמה מדעת מכל החולים. לצורך המחקר בב…

Representative Results

כאן מתוארת המתודולוגיה היישומית לבידוד RBCs נגועים בפלסמודיום עם CFSE בבדיקת תרבות משותפת עם לימפוציטים ציטוטוקסיים. ראשית, אנו מספקים ייצוג סכמטי של אופן ביצוע הפרוטוקול, תוך שימוש בדגימות אנושיות שנדבקו ב-P. vivax (איור 1). לאחר מכן, תרשים זרימה מאויר כיצד להמשיך עם הפר…

Discussion

כאן אנו מתארים בדיקת מבחנה למדידת הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים. בדיקה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני ההגנה התאית לשלב האריתרוציטי של טפיל המלריה. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מספקת בדיקה כמותית של הרג בתיווך תאים של iRBCs שניתן להש…

Materials

100 μM cell strainer	Corning	431752
96 Well Round (U) Bottom Plate	Thermo Scientific	12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody	Biolegend	349114	Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317314	Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody	Biolegend	344714	Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody	Biolegend	331408	Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100733	Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody	Biolegend	116223	Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	26140079
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP	meithel pharma	71228-400-003	Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane	Piramal critical care	66794-0013-25
LS MACS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Bioscience
Percoll	Cytiva	17089101	Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;	BD	14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml	BD	366480