Qui descriviamo un nuovo metodo per aiutare a chiarire i meccanismi dell’immunità cellulare al Plasmodium durante la fase ematica dell’infezione. Questo è un test in vitro che misura l’uccisione dei globuli rossi infetti da parte dei linfociti citotossici.
La malaria è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica, presentando oltre 200 milioni di casi all’anno in tutto il mondo. Nonostante anni di sforzi scientifici, l’immunità protettiva alla malaria è ancora poco conosciuta, principalmente a causa dei limiti metodologici della coltura di Plasmodium a lungo termine, in particolare per il Plasmodium vivax. La maggior parte degli studi si è concentrata sulla protezione dell’immunità adattativa contro la malaria da parte degli anticorpi, che svolgono un ruolo chiave nel controllo della malaria. Tuttavia, la protezione sterile indotta dai vaccini attenuati contro gli sporozoiti del Plasmodium è correlata alla risposta cellulare, principalmente ai linfociti T citotossici, come le cellule T CD8+ e gamma delta (γδ T). Pertanto, devono essere sviluppate nuove metodologie per comprendere meglio le funzioni della risposta immunitaria cellulare e quindi supportare la terapia futura e lo sviluppo di vaccini. Per trovare una nuova strategia per analizzare questa immunità cellulo-mediata all’infezione da stadio ematico del Plasmodium, il nostro gruppo ha stabilito un test in vitro che misura l’uccisione dei globuli rossi infetti (iRBC) da parte dei linfociti citotossici. Questo test può essere utilizzato per studiare i meccanismi di risposta immunitaria cellulare contro diversi Plasmodium spp. nella fase del sangue. Le cellule immunitarie citotossiche innate e adattative possono eliminare direttamente gli iRBC e il parassita intracellulare in un meccanismo effettore:bersaglio. Gli iRBC bersaglio sono marcati per valutare la vitalità cellulare e cocoltati con cellule effettrici (cellule CD8+ T, γδ T, cellule NK, ecc.). La percentuale di lisi viene calcolata in base alle condizioni testate, rispetto a un controllo spontaneo della lisi in un test basato sulla citometria a flusso. In definitiva, questa metodologia di analisi dell’uccisione è un importante progresso nella comprensione dell’immunità cellulo-mediata alla malaria in fase ematica, aiutando a scoprire nuovi potenziali bersagli terapeutici e accelerare lo sviluppo di vaccini contro la malaria.
La malaria rimane una crisi sanitaria globale, con oltre 240 milioni di casi e 627.000 decessi correlati alla malaria segnalati nel 20201. Attualmente ci sono cinque specie parassitarie che possono causare la malaria negli esseri umani, tra cui Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax sono le due specie più diffuse. Durante l’infezione da Plasmodium , il fegato o lo stadio pre-eritrocitico è asintomatico e i sintomi si verificano solo durante il ciclo asessuato del parassita nella fase eritrocitica. In questa fase dell’infezione, migliaia di merozoiti derivati dallo stadio epatico vengono rilasciati nel flusso sanguigno e infettano i globuli rossi (RBC). Nei globuli rossi, i parassiti si differenziano in trofozoiti e schizonti per schizogonia, fino a quando gli schizonti rompono l’eritrocita, rilasciando merozoiti appena formati, ripetendo questo ciclo sanguigno. Cicli ripetuti di invasione, replicazione e rilascio di merozoiti provocano una crescita esponenziale della popolazione di parassiti e alla fine innescano i sintomi della malattia2.
Una sfida importante nello studio della risposta immunitaria alla malaria è che il Plasmodium spp. che infetta gli esseri umani non infetta i modelli animali da laboratorio. Pertanto, i campioni di pazienti infetti da plasmodio devono essere raccolti freschi e immediatamente elaborati e analizzati. Tuttavia, nelle aree endemiche della malaria, le risorse per accedere ai meccanismi immunologici e molecolari sono limitate. A causa di queste limitazioni, i roditori sono ampiamente utilizzati come modelli sperimentali per studiare la risposta immunitaria contro l’infezione da Plasmodium. Mentre P. berghei e P. chabaudi sono spesso usati come surrogati per l’infezione da P. falciparum, il ceppo non letale di P. yoelii 17XNL ha anche molte caratteristiche in comune con P. vivax, come l’infezione limitata ai reticolociti 3,4. Lo sviluppo di saggi in vitro di Plasmodium, che possono essere utilizzati per campioni derivati da modelli umani o animali, è prezioso per ottenere una migliore comprensione della patogenesi della malaria e confrontare la risposta immunologica suscitata da diverse specie del parassita.
L’immunità antimalarica protettiva non è completamente compresa né allo stadio pre-eritrocitico né allo stadio sanguigno. È noto che l’esposizione a infezioni ripetute provoca un’immunità acquisita parziale, ma l’immunità sterile è raramente sviluppata5. Per decenni, l’immunità protettiva anti-Plasmodium è stata principalmente associata all’induzione di anticorpi neutralizzanti o opsonizzanti che impediscono l’invasione parassitaria delle cellule ospiti o portano alla fagocitosi da parte delle cellule presentanti l’antigene, rispettivamente6. Di conseguenza, la maggior parte degli sforzi per produrre vaccini antimalarici finora si sono basati sull’induzione di anticorpi protettivi e di lunga durata 7,8. Tuttavia, la protezione sterile indotta dalla vaccinazione con uno sporozoite attenuato è direttamente correlata con l’attivazione e l’espansione dei linfociti T citotossici 8,9.
Recentemente, alcuni studi su campioni di pazienti appena isolati e colture in vitro hanno dimostrato che le cellule immunitarie citotossiche innate o adattative come CD8 + T 10, γδ T11 e cellule NK12 possono eliminare direttamente i globuli rossi infetti da plasmodio e il suo parassita intracellulare in modo effettore:rapporto bersaglio. Questi risultati seminali hanno definito un meccanismo effettore immunitario completamente nuovo nel contesto della malaria. Per analizzare questa nuova immunità antimalarica, è essenziale esplorare i meccanismi effettori citotossici delle cellule killer contro i globuli rossi infetti (iRBC) nell’infezione naturale o nella vaccinazione.
Qui presentiamo un test in vitro che misura l’attività citotossica dei linfociti contro la malaria nella fase del sangue. Questo test può quindi aiutare a chiarire i meccanismi della risposta immunitaria cellulare contro lo stadio eritrocitario del Plasmodium . Le cellule bersaglio, iRBC, sono marcate con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) per valutare la vitalità cellulare e sono quindi cocoltivate con cellule effettrici come i linfociti citotossici (CTL). Questa cocoltura viene quindi valutata mediante citometria a flusso, utilizzando marcatori fluorescenti per specifici tipi di cellule. Infine, la percentuale di lisi di iRBC da CTL viene calcolata dividendo la condizione sperimentale per la rottura spontanea dei globuli rossi e il controllo spontaneo della lisi, che si verifica durante l’incubazione senza la cellula effettrice. Nel complesso, questa metodologia di analisi dell’uccisione può contribuire a una migliore comprensione dell’immunità alla malaria cellulo-mediata.
Qui descriviamo un test in vitro per misurare l’uccisione dei globuli rossi infetti da plasmodio da parte dei linfociti citotossici. Questo test può aiutare a chiarire i meccanismi dell’immunità protettiva cellulare allo stadio eritrocitico del parassita della malaria. Il principale vantaggio di questa metodologia è che fornisce un test quantitativo dell’uccisione cellulo-mediata degli iRBC che può essere utilizzato per affrontare molte domande su come le cellule immunitarie interagiscono con divers…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dr. Dhelio Pereira e i membri del Centro di Ricerca per la Medicina Tropicale di Rondônia (CEPEM) per l’arruolamento dei pazienti affetti da malaria e la raccolta del sangue e Felicia Ho per aver aiutato con la revisione del manoscritto. Il seguente reagente è stato ottenuto tramite BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Ceppo 17XNL:PyGFP, MRA- 817, con il contributo di Ana Rodriguez. Questa ricerca è stata sostenuta da Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, borse di studio (CJ, GC, CG) e Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – fellowship (LL).
100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |