Summary
在这里，我们描述了一种新方法，以帮助阐明感染血液阶段细胞对 疟原虫 免疫的机制。这是一种 体外 测定，用于测量细胞毒性淋巴细胞对感染红细胞的杀伤。
Abstract
疟疾是一个重大的公共卫生问题，每年在全世界造成2亿多例病例。尽管经过多年的科学努力，对疟疾的保护性免疫仍然知之甚少，这主要是由于长期疟原 虫 培养的方法学局限性，特别是 间日疟原虫。大多数研究都集中在抗体对疟疾的适应性免疫保护上，抗体在控制疟疾方面起着关键作用。然而，减毒 疟原虫 孢子体疫苗诱导的无菌保护与细胞反应有关，主要与细胞毒性T淋巴细胞有关，如CD8+ 和γδT细胞（γδT）。因此，必须开发新的方法来更好地理解细胞免疫反应的功能，从而支持未来的治疗和疫苗开发。为了找到一种新的策略来分析这种细胞介导的对 疟原虫 血期感染的免疫力，我们小组建立了一个体 外 测定法，用于测量细胞毒性淋巴细胞对感染红细胞（iRBC）的杀伤。该测定可用于研究血液阶段针对不同 疟原虫属 的细胞免疫应答机制。先天性和适应性细胞毒性免疫细胞可以通过效应：靶机制直接消除iRBC和细胞内寄生虫。标记靶iRBC以评估细胞活力，并与效应细胞（CD8 + T，γδ T，NK细胞等）共培养。裂解百分比是根据测试条件计算的，与基于流式细胞术的测定中的自发裂解对照进行比较。最终，这种杀伤测定方法是了解细胞介导的血期疟疾免疫力的重大进步，有助于发现新的潜在治疗靶点并加速疟疾疫苗的开发。
Introduction
疟疾仍然是一场全球卫生危机，2020年报告了超过2.4亿例病例和62.7万例疟疾相关死亡1。目前有五种寄生虫物种可引起人类疟疾，其中 恶性疟原虫 和 间日疟原虫 是两种最普遍的物种。在 疟原 虫感染期间，肝脏或前红细胞期是无症状的，症状仅在寄生虫的红细胞期无性周期中出现。在这个感染阶段，来自肝脏阶段的数千种裂殖子被释放到血液中并感染红细胞（RBC）。在红细胞中，寄生虫通过分裂分裂分化为滋养体和裂殖体，直到裂殖子破裂红细胞，释放新形成的裂殖子，重复这个血液循环。反复的入侵、复制和裂殖子释放循环导致寄生虫种群呈指数级增长，并最终引发疾病症状2.
研究对疟疾的免疫反应的一个重要挑战是疟原虫属。 感染人类不会感染实验动物模型。因此，必须新鲜采集感染疟原虫的患者样本，并立即进行处理和分析。然而，在疟疾流行地区，获取免疫学和分子机制的资源有限。由于这些限制，啮齿动物被广泛用作实验模型来研究对疟原虫感染的免疫反应。虽然 P. berghei 和 P. chabaudi 经常被用作恶性疟原虫感染的替代物，但 P. yoelii 17XNL 的非致死菌株也与间日疟原虫有许多共同特征，例如网织红细胞限制性感染 3,4。可用于人类或动物模型衍生样品的疟原虫体外测定的发展对于更好地了解疟疾的发病机制和比较不同种类的寄生虫引起的免疫反应很有价值。
保护性抗疟免疫在红细胞前期和血液阶段都不完全了解。众所周知，暴露于反复感染会导致部分获得性免疫，但很少产生无菌免疫5。几十年来，抗疟原虫保护性免疫主要与诱导中和或调理抗体有关，这些抗体分别防止寄生虫入侵宿主细胞或导致抗原呈递细胞吞噬作用6。因此，迄今为止生产抗疟疫苗的大多数努力都依赖于诱导保护和持久的抗体7,8。然而，用减毒孢子体接种疫苗诱导的无菌保护与细胞毒性T淋巴细胞8,9的活化和扩增直接相关。
最近，一些对新鲜分离的患者样本和体外培养物的研究表明，先天性或适应性细胞毒性免疫细胞如CD8+ T 10，γδ T11和NK细胞12可以以效应：靶比的方式直接消除疟原虫感染的红细胞及其细胞内寄生虫。这些开创性的发现在疟疾的背景下定义了一种全新的免疫效应机制。为了剖析这种新型抗疟免疫，必须探索杀伤细胞在自然感染或疫苗接种中对感染红细胞（iRBC）的细胞毒性效应机制。
在这里，我们提出了一种 体外 测定法，用于测量淋巴细胞在血液阶段对疟疾的细胞毒性活性。然后，该测定可以帮助阐明针对 红细胞期 的细胞免疫反应的机制。靶细胞iRBCs用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记以评估细胞活力，然后与细胞毒性淋巴细胞（CTL）等效应细胞共培养。然后通过流式细胞术评估这种共培养物，使用特定细胞类型的荧光标记物。最后，通过将实验条件除以红细胞的自发破裂和自发裂解控制来计算CTL的iRBC裂解百分比，这发生在没有效应细胞的孵育期间。总体而言，这种杀伤测定方法有助于更好地了解细胞介导的疟疾免疫力。
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Protocol
所有程序均按照奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会和国家伦理委员会（CAAE：59902816.7.0000.5091）的政策进行。人类方案是与朗多尼亚热带医学研究中心（CEPEM）的临床研究小组合作开发的，该中心负责招募患者参加研究。获得所有患者的知情同意。
对于动物研究，程序按照国家动物实验控制委员会（CONCEA）的《巴西科学和教学目的动物护理和使用实践指南》的行为原则进行。这些协议由Fiocruz动物实验委员会批准（CEUA协议LW15 / 20-2）。
1. 采集人体血液样本及PBMC分离
- 在装有肝素钠的 10 mL 真空采血管中收集 疟原虫感染患者的血液。当疟疾患者出现淋巴细胞减少时，10 mL 血液样本中存在 5-9 x 106 个外周血单核细胞 （PBMC）。由于CD8 + T细胞或γδ T细胞占PBMC的~10%，因此最好收集50-100mL的血液/患者。
注意：应考虑至少 1 x 105 个效应细胞/条件。 - 通过血涂片计算iRBC的百分比，如下所述。
- 将 5 μL 总血液加入透明载玻片中并准备血涂片。进行罗曼诺夫斯基型全光学快速染色或梅-金瓦尔德-吉姆萨染色。这里使用全光学快速染色试剂盒，它由三种试剂组成：试剂A（固定）、试剂B（细胞质染色）和试剂C（细胞核和细胞质差异染色）。
- 将载玻片缓慢浸入溶液A中10x，然后在溶液B中浸入4x，最后在溶液C中浸出10x.从溶液之间的载玻片中排出多余的试剂。浸入溶液C后，用流动的自来水冲洗载玻片并使其干燥。
- 在带有100倍油浸物镜的正置光学显微镜下，以连续的平方计数1000个红细胞，并使用以下公式计算寄生虫血症的百分比：
- 在无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中以 1：1 的比例稀释 15 mL 血液。
- 将 15 mL 淋巴细胞分离培养基（密度为 1.077g/mL）加入 50 mL 管中。小心地将 30 mL 稀释的血液样品分层到离心介质溶液上。分层样品时，不要让血液样品和淋巴细胞分离介质混合。
- 在22°C下以400× g 离心管40分钟，低加速度且无断裂设置。
- 使用无菌移液管抽出含有血浆的上层，使单核细胞层不受干扰。使用无菌移液管将单核细胞（PBMC）层转移到无菌管中。
- 不要丢弃含有血球的试管，因为它稍后将用于感染的红细胞分离。从此步骤开始，请确保将红细胞保持在室温 （RT） 下。永远不要让他们冷静下来。
- 通过加入PBS洗涤细胞两次，并以350 x g 离心10分钟，并设置休息。将细胞沉淀重悬于补充有青霉素/链霉素和 10% 胎牛血清（FBS;完全培养基）的 5 mL RPMI 培养基中。
- 在台盼蓝溶液存在下计数PBMC，以使用血细胞计数器（Neubauer室）或自动细胞计数器检查细胞活力。不要计算蓝色染色的细胞，因为它们代表吸收台盼蓝的垂死细胞。
- 使用完全培养基将细胞浓度调节至 107 个 细胞/mL。根据试剂制造商方案，使用磁珠分离纯化所需的细胞毒性淋巴细胞群（CD8+ T 细胞、NK 细胞、γδ T 细胞）。
2. 人类红细胞分离
注意：对于人类感染的红细胞分离，建议从寄生虫血症至少为 2% 的血液样本开始，最好在滋养体/早期裂殖子寄生虫阶段使用更多。
- 以如下所述推荐浓度制备PERCOLL（以下简称密度梯度分离介质）。
- 加入 90 mL 的 100% 密度梯度分离介质和 10 mL 的 10x PBS，以获得 90% 等渗密度梯度分离培养基。
- 对于 间日疟原虫感染的网织红细胞分离，制备45%密度梯度分离培养基。加入 50 mL 的 90% 等渗密度梯度分离介质和 50 mL 的 1x PBS，以获得 45% 密度梯度分离培养基。
- 对于 恶性疟原虫感染的红细胞分离，制备65%密度梯度分离培养基。加入 72 mL 的 90% 等渗密度梯度分离培养基和 28 mL 的 1x PBS，以获得 65% 密度梯度分离介质。
- 对于未感染的网织红细胞分离，制备70%密度梯度分离培养基。加入 78 mL 90% 等渗密度梯度分离培养基和 22 mL 1x PBS 以获得 70% 密度梯度分离培养基。
- 在水浴中将密度梯度分离介质加热至37°C。
- 去除PBMC层后，在不接触细胞的情况下，尽可能小心地去除离心介质的顶层。使用玻璃巴斯德移液器，小心地去除上层中性粒细胞层，不要干扰红细胞沉淀并估计颗粒体积。加入 4 倍 RBC 沉淀体积的 RT 完全培养基并重悬。
- 在第二个 50 mL 锥形管中，根据要分离的细胞类型，加入 5 倍的 45%、65% 或 70% 密度梯度分离培养基的沉淀体积。小心地将RBC悬浮液分层在密度梯度分离介质层的顶部。
- 以 850 x g 旋转 15 分钟，低加速度且无中断设置。用 5 mL 移液管收集位于上清液和密度梯度分离介质之间的混浊红色/棕色层。转移到无菌 15 mL 管中。
- 通过加入高达 15 mL 的 RT 完全培养基来洗涤细胞，并以 860 x g 离心 10 分钟。通过加入 10 mL RT 完全培养基并旋转下来重复洗涤。按照步骤1.2丢弃上清液并从沉淀中制备血涂片以检查iRBC富集。
- 将沉淀重悬于1 mL RT完全培养基中，并在室温下静置，同时计数细胞。在血细胞计数器（Neubauer室）中加入10μL细胞悬液，并计数中心区域的红细胞细分为25个培养基正方形。在室温完全培养基中将细胞浓度调节至 1 x 107 iRBC/mL。
3.小鼠实验性疟疾感染
- 解冻等分冷冻保存 的约利假单胞菌 17XNL：PyGFP （MRA-817），一种从 MR4/ATCC 获得的表达 GFP 的菌株， 并在 8 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠中腹膜内 （ip） 注射 100 μL。
- 每 3 天通过尾静脉采血跟踪寄生虫血症负荷。
- 用斜面的针刺穿血管，从尾巴的远端开始以浅角度进入静脉。
- 用移液管或毛细管收集高达 5 或 10 mL 的血液样本，然后手动按压止血。
- 准备血涂片（如步骤1.2中所述），直到寄生虫血症达到10%-15%的感染红细胞。
- 通过尾静脉切口收集 10 μL 血液并稀释至 100 μL PBS 以腹腔静脉注射到第二只供体小鼠中。
注意：冷冻保存的寄生虫在用于实验性感染之前应解冻并在小鼠中传播两次。 - 当第二次传代达到寄生虫血症的15%时，通过尾部夹法收集五滴血液，并在1mL的PBS中稀释。通过将无菌PBS中的浓度调节至1 x 106 iRBC / mL来制备感染溶液，并将ip. 100μL（1 x 105 iRBC）溶液注入实验所需的每只小鼠中。
- 每 2-3 天监测一次寄生虫血症，直到其达到 ~30% iRBC，这发生在感染后约 12 天。当小鼠达到所需的寄生虫血症时，如下所述通过心脏穿刺收集血液。
- 用 26 G 针头将 100 μL 肝素溶液 （30 U/mL） 吸入 1 mL 注射器中。
- 用5%异氟醚吸入麻醉小鼠并确认没有反射。将鼠标侧放，将针垂直插入肘部下方，穿过肋骨并插入心脏。缓慢拉出注射器柱塞并旋转针头，直到获得0.5-1mL血液。
- 在麻醉下通过颈椎脱位进行人道安乐死。用70%乙醇无菌清洁小鼠左侧。用手术剪刀在穿过皮肤和腹膜的小鼠左侧切开。找到脾脏并将其移除。
- 将小鼠脾脏放入装有 5 mL 完全培养基的培养皿中，以纯化所需的效应细胞群（例如 CD8+ T 细胞）。
4.获得新鲜的全小鼠脾细胞
- 在培养皿中，用剪刀或剃刀小心地将脾脏切成小块。
- 将 100 μM 细胞过滤器放在 50 mL 锥形管上，并用移液管将切除的脾脏转移到细胞过滤器中。用注射器柱塞将脾脏捣碎通过过滤器。
- 用 10 mL 完整培养基通过过滤器清洗细胞。将细胞在4°C下以300× g 离心10分钟，然后弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 2 mL 冷 1x RBC 裂解缓冲液中。将悬浮液在冰上孵育5分钟。
- 用10mL的4°C完全培养基洗涤细胞悬液。重复洗涤步骤三次，并在两次洗涤之间去除任何细胞凝块，以检测疟 原虫感染小鼠的脾脏。
- 在4°C下以400× g 离心细胞5分钟，然后弃去上清液。
注意： 疟原虫感染的脾脏肿大并充满含有降解血红蛋白和血红素的吞噬细胞。 - 为避免在效应细胞的磁珠分离过程中出现任何问题，请使用以下步骤去除富含血红素的吞噬细胞和血红素。用MACS缓冲液重悬脾细胞，并将浓度调节至1 x 108 个细胞/ mL。将LS或LD柱置于磁场中。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗制备色谱柱。
- 将细胞悬液涂在色谱柱上。用 3 mL MACS 缓冲液洗涤色谱柱 3 次。收集含有脾细胞的流通物。
- 计数台盼蓝溶液中的脾细胞，并在血细胞计数器（Neubauer室）或自动细胞计数器中检查细胞活力。在室温完全培养基中将细胞浓度调节至 1 x 107 个细胞/mL。
5.细胞毒性效应细胞纯化（CD8a+ T细胞阴性选择）
注意：有许多阳性和阴性选择试剂可以纯化细胞毒性效应细胞（CD8 + T，γδ T，NK，iNKT，MAIT细胞）。在该协议中，我们使用阴性选择的脾CD8a + T细胞并遵循制造商的说明。
- 在4°C下以400× g 离心所有脾细胞10分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 40 μL MACS 缓冲液中。
- 加入 10 μL 生物素抗体混合物。充分混合并在冰上孵育5分钟。
- 加入 30 μL MACS 缓冲液。加入 20 μL 抗生物素微珠。充分混合并在冰上孵育10分钟。
- 加入 400 μL MACS 缓冲液，然后进行磁性细胞分离。将 MACS LS 列放在磁场支架中。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗制备色谱柱。
- 将细胞悬液涂在色谱柱上。用 3 mL MACS 缓冲液洗涤色谱柱 3 次。收集包含所有未标记细胞的流通细胞，这些细胞是富集的CD8a + T细胞。
- 计数台盼蓝溶液中的CD8a + T细胞，并在血细胞计数器（Neubauer室）或自动细胞计数器中检查细胞活力。在RT完全培养基中将细胞浓度调节至1 x 107 细胞/ mL。
6. 约利假单胞菌 感染红细胞分离
- 将收集的血液在 1.5 mL 管中以 850 x g 离心 3 分钟。丢弃血清并将血液重悬于 1 mL 的 1x RPMI 中，不含 FBS。
- 将LS柱放在磁场支架中，并用3 mL的1x RPMI冲洗。将 RBC 悬浮液通过色谱柱。要分离更多iRBC，请将流通物（3 mL RPMI和1 mL稀释血液）重新注入色谱柱中。
- 用 5 mL 的 1x RPMI 洗涤两次。在色谱柱储液槽为空后立即添加缓冲液等分试样来执行洗涤步骤。不要让任何列干涸。
- 加入 5 mL RPMI，取出色谱柱，然后将 iRBC 吹扫到新的 15 mL 管中。计数iRBC并将浓度调节至1 x 107 RBC / mL。
7. 红细胞的CFSE标记和流式细胞术的制备
注意：使用两倍于实验的细胞数量开始RBC标记方案，因为~50%的细胞通常在CFSE标记步骤后的洗涤步骤中丢失。为了建立红细胞/iRBC的自发荧光，包括未标记细胞的对照样品。
- 在没有FBS的情况下，在1x RPMI中将CFSE稀释至终浓度为10 mM。在 15 mL 管中用不含 FBS 的 1x RPMI 洗涤细胞一次。
- 将红细胞重悬于不含FBS的500 μL 1x RPMI中，并加入500 μL稀释的CFSE。在室温下孵育8分钟，避光。
- 通过加入 14 mL 完全培养基 （10% FBS RPMI） 洗涤 3 次，然后在 850 x g 下离心 10 分钟。将细胞重悬于完全培养基中至浓度为1-5 x 106/ mL。在室温下孵育1小时。
8. 细胞毒性淋巴细胞/红细胞共培养及流式细胞术制备
注意：如果要测量特定受体或分子的参与，请在共培养前将特异性封闭和同种型对照抗体（10mg / mL）与效应细胞孵育30分钟。
- 将细胞铺在96孔圆底板中。将纯化的淋巴细胞和CFSE标记的iRBC以所需的效应-靶细胞比例加入至200μL的最终体积并匀浆。准备每个条件一式三份。
注意：我们建议将iRBC浓度调整为1-5 x 104 个细胞/mL，并根据纯化的细胞数（例如，0.5：1、2.5：1和5：1）选择比例。 - 包括自发裂解对照，即没有效应物的靶iRBC，以评估任何自发裂解，因为这将用于代表100%的细胞活力条件。
- 以360 x g 旋转板1分钟，以最大化细胞接触。在37°C和5%CO2下孵育4小时。
注意：系统地用于恶性疟原虫培养的缺氧条件（低O2）不应使用，因为效应细胞在这种环境中无法存活。相比之下，疟原虫寄生虫在环境空气中以5%CO2存活长达12小时。 - 以850 x g 旋转5分钟，翻转板以除去上清液。
注意：如果需要，上清液可用于测量共培养物中释放的任何可溶性因子。 - 用抗小鼠Ter119 1：200（或人类样品的抗人CD235 1：100）标记红细胞，用抗CD8 1：200或抗CD3 1：200抗体（抗小鼠或人）在含有3%FBS（FACS缓冲液）的1x PBS中在4°C下标记CD30分钟 。
注意：抗体荧光团应根据细胞示踪剂/细胞增殖试剂（例如，CFSE 标记的 iRBC、APC-Cy7 抗 Ter-Ter119 和 PerCP-Cy5.5 抗 CD8a）进行选择。 - 用FACS缓冲液洗涤细胞并以850×g旋转5分钟。 将样品转移到FACS管中，并向单个管中加入30μL计数珠 。 通过涡旋30秒使计数珠均质化。
9. 流式细胞术
- 使用 405/488/561/640 激光仪器分析样品。
- 对于用 CFSE （FITC）、PE 抗人 γδ TCR 和 PE-Cy7 抗人 CD235a 抗体标记的人细胞，在三激光（蓝色、红色、黄绿）配置细胞仪中使用 530/30 （FITC）、575/25 （PE） 和 780/60 （PE-Cy7） 滤光片。
- 对于用CFSE（FITC），PerCP-Cy5.5抗小鼠CD8a和APC-Cy7抗小鼠Ter119标记的小鼠细胞，在三激光细胞仪设置中使用530/30（FITC），695/40（PerCP-Cy5.5）和780/60（APC-Cy7）滤光片。
- 选择计数磁珠群作为停止门，以在停止门中获取至少 20,000 个事件，这些事件在所有条件下都应相同。使用适当的流式细胞术采集/分析软件进行分析和补偿。
- 设置门控策略，如下所述。
- 选择单个细胞（单晶），使用FSC峰高（H）与面积（A）之比排除碎片。选择红细胞，并根据红细胞标志物（Ter119或CD235a）和淋巴细胞特异性抗体（CD8a）的荧光从分析中排除淋巴细胞。
- 在先前的红细胞门控中，根据 CFSE 阳性染色选择活的红细胞。使用流式细胞仪数据分析软件分析数据。
10. 计算和统计
- 要计算iRBC裂解的百分比，请遵循步骤9中描述的设门策略。活红细胞的百分比是基于Ter119（小鼠）或CD235a（人）阳性荧光的红细胞门内CFSE阳性细胞的频率。
- 使用自发裂解对照，无效应细胞的红细胞，条件作为对照来估计红细胞自发破裂。这种情况将被视为红细胞裂解（100%活力）。使用以下公式计算每种测试条件下红细胞裂解的百分比：
注意：在培养培养期间，一些受感染的红细胞可能会自发裂解或被寄生虫破裂。使用不含效应细胞的自发溶解条件的 CFSE 阳性红细胞频率作为淋巴细胞细胞毒性的基线。 - 计算每个条件的一式三份的平均值，并在多重比较中使用双向方差分析确定统计显著性。
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Representative Results
在这里，描述了在与细胞毒性淋巴细胞共培养测定中分离CFSE标记 的疟原虫感染红细胞的应用方法。首先，我们提供了如何执行协议的示意图，使用感染 了间日疟原虫 的人类样本（图1）。然后，有关如何使用感染 约氏疟原虫 的C57BL / 6小鼠在疟疾实验模型中进行方案的图示流程图（图2）。 在图3中，显示了协议步骤6（使用磁柱富集感染的约 氏疟原虫）的预期结果（之前和之后）。最后， 图4显示了具有代表性的流式细胞术分析，详细说明了评估红细胞裂解百分比所需的门控策略，如步骤9所述。因此，本节重点介绍此处使用的不同技术，描述采集、组装和数据分析的整个过程，以评估细胞毒性淋巴细胞对iRBC的杀伤。
人 疟原虫感染的红细胞通过细胞毒性细胞裂解
图1显示了评估细胞毒性细胞杀死人疟原虫感染红细胞的方案示意图。为了测量细胞裂解，使用分离培养基纯化疟原虫感染患者的PBMC，然后对感兴趣的细胞毒性淋巴细胞（CTL）群体（例如CD8 + T，γδ T，NK，iNKT，MAIT细胞等）进行磁纯化。PBMC分离中剩余的红细胞沉淀用于使用密度梯度分离培养基（65%恶性疟原虫;45%间日疟原虫）富集疟原虫感染的红细胞。用CFSE标记iRBC，并在37°C，5%CO2下用或不带淋巴细胞孵育4小时。在共培养期之后，在流式细胞术分析之前，用抗人CD235a抗体（用于红细胞）和CTL特异性抗体（例如，抗CD8，抗γδTCR等）标记所有红细胞（感染或未感染）。人类样品的采集和分析与图4中小鼠样品的采集和分析相似。
约利卦虫感染的红细胞通过细胞毒性CD8 + T细胞裂解
图2显示了评估实验疟疾模型中细胞毒性效应机制的实验程序流程图，以及图3和图4所示的代表性实验数据。C57BL/6小鼠感染1 x 105Yoeii（Py）iRBC，并监测寄生虫血症直至达到约30%。使用磁分离从血液中分离Py-iRBC，因为寄生虫血红素副产物血红素富含铁，在磁场中作为顺磁性颗粒起作用13。通过血涂片与柱前样品进行比较分析富集样品的纯度（图3）。然后用细胞示踪试剂CFSE标记iRBC。同时，使用磁性阴性选择试剂盒从脾细胞中纯化细胞毒性CD8 + T细胞。作为对照，使用相同的方案从未感染的小鼠中纯化CD8 + T细胞。将效应细胞（CD8 + T）和靶细胞（CFSE标记的Py-iRBC）细胞以不同的效应子：靶标比（E：T：0.5：1,2.5：1和5：1）在37°C 5%CO2下孵育4小时。在共培养结束时，每种病症都用抗小鼠Ter119抗体标记红细胞和抗CD8a抗体标记细胞毒性细胞。门控策略和样品结果如图4所示。
图1. 体 外杀伤测定示意图。 杀灭测定实验示例。使用分离梯度培养基收集和处理疟 原虫感染的血液。离心后，收集PBMC层，并使用磁珠纯化细胞毒性细胞（CTL）。红细胞层再次使用密度梯度分离介质进行处理。离心后，收集 疟原虫-iRBC层并用CFSE标记。此后，将纯化的CTL和iRBC在37°C，5%CO2共培养4小时，然后在流式细胞仪中进行细胞特异性标记和分析。 请点击此处查看此图的大图。
图2.用于杀伤测定的实验疟疾模型。 首先，C57BL / 6小鼠感染105 个PyX17NL感染的红细胞。然后，通过血涂片监测寄生虫血症，直到感染高峰（30%-40%iRBC），大约在感染后12天（dpi）。第二天，对小鼠放血并实施安乐死以进行脾脏收集。对血液进行处理，通过磁分离富集感染的红细胞，然后用CFSE标记（右上）。通过使用磁珠的阴性选择处理脾脏以进行细胞毒性淋巴细胞分离。之后，将纯化的细胞毒性淋巴细胞和iRBC在37°C，5%CO2下共培养4小时，然后在流式细胞仪中进行细胞特异性标记和分析。 请点击此处查看此图的大图。
图3.使用磁性柱富集 iRBC。 使用LS柱从 约利假单胞菌 感染的小鼠中纯化iRBC。在 （A） 柱富集之前和 之后 收集的血液涂片突出了纯化。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4.通过CD8 +淋巴细胞评估约利假单胞菌-iRBC的细胞裂解百分比。细胞裂解百分比的门控策略。（A） 将停止门设置为计数珠群（~20,000 个事件）。 （B）控制自发溶解，无淋巴细胞的iRBC。通过根据FSC峰高面积比选择单个细胞（不包括碎片）来开始门控策略，然后在APC-Cy7 Ter119阳性和PerCP-Cy5.5 CD8阴性中选择RBC群体。然后选择活的iRBC作为CFSE（FITC）高阳性。（C）使用不同效应器的示例实验分析：目标比率，显示共培养后活红细胞的百分比。（D）根据第10节所述的公式计算的红细胞裂解百分比的图形表示。通过具有多重比较的双向方差分析评估组间显著性比较（细胞毒性CD8或幼稚CD8）。P < 0.0001 （****）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这里，我们描述了一种体外测定法，以测量细胞毒性淋巴细胞对疟原虫感染的红细胞的杀伤。该测定可以帮助阐明对疟疾寄生虫红细胞阶段的细胞保护性免疫机制。该方法的主要优点是它提供了细胞介导的iRBCs杀伤的定量测定，可用于解决有关免疫细胞如何与不同疟原虫属相互作用的许多问题。
重要的是，该方法可用于研究间日疟原虫和其他未维持体外培养的疟原虫14,15。此外，该协议可以适用于任何疟原虫物种和不同的宿主，例如人类、小鼠和非人类灵长类动物。基于流式细胞术的方法广泛用于评估细胞毒性细胞活化、细胞因子产生和脱颗粒10,11,16，但目前的方法是唯一一种通过直接接触杀伤细胞来探索红细胞裂解的方法。
还有许多方法，如显微镜检查、聚合酶链反应 （PCR） 和流式细胞术，用于通过测量寄生虫血症、侵袭和抗疟活性来研究疟疾。然而，为了分析细胞介导的红细胞毒性，目前使用Cr51或血红蛋白释放的方法不够灵敏，无法评估红细胞裂解。LDH释放也可用于评估一些CTL如CD8 + T细胞的红细胞杀伤，但测量LDH不是一种准确的方法，因为活化的先天或先天样细胞可能作为一种调节机制相互杀伤。
CFSE广泛用于在流式细胞术或荧光显微镜中跟踪细胞或探索细胞增殖17。由于红细胞不会增殖18，因此CFSE荧光强度应随着细胞裂解而降低。流式细胞术是一种非常准确的技术，因为它可以检测非常低水平的特定标志物，因此它已被广泛用于追踪疟疾感染中的寄生虫血症和入侵19,20,21,22,23。最重要的是，流式细胞术可以测量单个细胞中的许多参数，并将细胞分选为不同的群体。通过向每个样品添加定量标准试剂（计数珠），可以归一化采集事件的数量并获得绝对细胞计数24。该方法允许在实验条件之间进行可靠的定量比较，这对于当前提出的协议至关重要。
该协议的一些关键步骤包括确保样品质量，确保适当的细胞染色，以及包括用于标准化计算的对照。需要大量的新鲜血液样本来纯化受感染的红细胞。应仔细处理密度梯度分离培养基纯化，因为其浓度对于获得所需的 疟原虫 iRBC至关重要。 还必须尽可能缓慢地将血液覆盖到密度梯度分离培养基上，并且必须小心地进行环红层收获，以避免丢失iRBC。为了使纯化过程更容易，应使用高寄生虫血症血液样本，因为iRBC的量会更高。应该注意的是，在使用磁场的红细胞分离方案中，只有产生大量血红素的寄生虫成熟阶段（中后期滋养体或裂殖子）才会被纯化。因此，不会收集任何环形阶段，这可能会影响最终结果。
应仔细进行细胞染色，以避免细胞丢失或裂解。染色前应避免长时间储存或固定。重要的是要注意，实验条件应使用连续效应器：目标比率和适当的对照（例如未标记的自发裂解条件和假设对照）一式三份进行。添加细胞计数微球至关重要，因为它提供了一种简单的方法来确定每个样品的细胞浓度或绝对细胞计数。在流式细胞仪采集过程中，请务必设置要在计数微球门中收集的事件数，以使共培养后每个样品中的细胞数标准化。
由于在共培养测定中至少需要1 x 105 个效应细胞才能获得一致的结果，因此所述方法的一个可能的局限性是纯化后的细胞数量有限，这可能是一个问题，尤其是在处理稀有细胞群时。事实上，这适用于iRBC纯化，因为它需要具有非常高的寄生虫血症，而这种寄生虫血症并不容易获得，尤其是在流行地区处理人类样本时。
方案改进之一可能是共培养孵育时间。虽然我们之前使用12小时孵育时间10,11，但我们最近观察到4小时足以区分实验条件，从而减少潜在自发裂解的时间并提高结果的可重复性。
直接杀死疟原虫感染的红细胞所涉及的机制正在逐渐被揭示。我们的小组是第一个证明CD8 + T细胞可以通过感染细胞的HLA-I呈递识别和杀死间日疟原虫感染的网织红细胞11。最近，另一项研究表明，γδ T 细胞通过丁绿素（存在于 iRBC10 表面的一种分子）的磷酸抗原识别恶性疟原来识别恶性疟原感染的红细胞。在这两项研究中，红细胞裂解是颗粒溶血素和颗粒酶B依赖性的，并导致细胞内寄生虫杀伤。
尽管多年来已经开发了许多方法来测量寄生虫血症、侵袭、抗疟活性和成像细胞相互作用，但在基于流式细胞术的定量测定中，没有一种方法能够分析细胞毒性细胞对 iRBC 的直接杀伤 19,20,21。我们使用一种创新方法，通过对疟原虫感染的红细胞进行CFSE标记，并评估与淋巴细胞共培养的特定时期的iRBC裂解，从而评估疟疾中的细胞裂解能力。因此，这种体外杀伤测定为阐明细胞介导的血期疟疾免疫机制提供了一种新策略，这将有助于推进新治疗靶点的研究和疟疾疫苗的开发。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Dhelio Pereira博士和朗多尼亚热带医学研究中心（CEPEM）的成员为疟疾患者招募和采血，并感谢Felicia Ho帮助修改手稿。以下试剂通过BEI Resources，NIAID，NIH获得： Plasmodium yoelii subsp. yoelii，菌株17XNL：PyGFP，MRA-817，由Ana Rodriguez提供。这项研究得到了莱曼巴西研究基金、国家科学和技术发展委员会（CNPq）-437851/2018-4、奖学金（CJ、GC、CG）和米纳斯吉拉斯州安帕罗基金会（FAPEMIG）的支持——APQ-00653-16、APQ-02962-18;高级国家研究金（爱尔兰）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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