In vitro Analys av plasmodiuminfekterade avdödande röda blodkroppar av cytotoxiska lymfocyter

Summary

Här beskriver vi en ny metod för att belysa mekanismerna för cellulär immunitet mot Plasmodium under infektionsstadiet i blodet. Detta är en in vitro-analys som mäter infekterade röda blodkroppar som dödar av cytotoxiska lymfocyter.

Abstract

Malaria är ett stort folkhälsoproblem och uppvisar mer än 200 miljoner fall per år över hela världen. Trots år av vetenskapliga ansträngningar är skyddande immunitet mot malaria fortfarande dåligt förstådd, främst på grund av metodologiska begränsningar av långsiktig Plasmodium-kultur, särskilt för Plasmodium vivax. De flesta studier har fokuserat på adaptivt immunitetsskydd mot malaria av antikroppar, som spelar en nyckelroll för att kontrollera malaria. Det sterila skydd som induceras av försvagade Plasmodium sporozoites-vacciner är emellertid relaterat till cellulärt svar, främst till cytotoxiska T-lymfocyter, såsom CD8⁺ och gamma delta T-celler (γδ T). Därför måste nya metoder utvecklas för att bättre förstå funktionerna i det cellulära immunsvaret och därmed stödja framtida terapi och vaccinutveckling. För att hitta en ny strategi för att analysera denna cellmedierade immunitet mot Plasmodium-blodstegsinfektion, etablerade vår grupp en in vitro-analys som mäter infekterade röda blodkroppar (iRBC) dödande av cytotoxiska lymfocyter. Denna analys kan användas för att studera cellulära immunsvarsmekanismer mot olika Plasmodium spp. i blodstadiet. Medfödda och adaptiva cytotoxiska immunceller kan direkt eliminera iRBC och den intracellulära parasiten i en effektor:målmekanism. Mål-iRBC är märkta för att utvärdera cellviabilitet och samodlade med effektorceller (CD8 ⁺ T, γδ T, NK-celler, etc.). Lysprocenten beräknas baserat på testade förhållanden, jämfört med en spontanlyskontroll i en flödescytometribaserad analys. I slutändan är denna dödsanalysmetod ett stort framsteg för att förstå cellmedierad immunitet mot malaria i blodstadiet, vilket hjälper till att avslöja nya potentiella terapeutiska mål och påskynda utvecklingen av malariavacciner.

Introduction

Malaria är fortfarande en global hälsokris, med mer än 240 miljoner fall och 627 000 malariarelaterade dödsfall rapporterade 2020¹. Det finns för närvarande fem parasitarter som kan orsaka malaria hos människor, varav Plasmodium falciparum och Plasmodium vivax är de två vanligaste arterna. Under Plasmodium-infektion är levern eller det pre-erytrocytiska stadiet asymptomatiskt, och symtom uppträder endast under parasitens asexuella cykel i det erytrocytiska stadiet. Vid detta infektionsstadium släpps tusentals merozoiter som härrör från leverstadiet ut i blodomloppet och infekterar röda blodkroppar (RBC). I RBC differentieras parasiterna till trofozoiter och schizonter av schizogoni, tills schizonter brister erytrocyten och släpper ut nybildade merozoiter och upprepar denna blodcykel. Upprepade cykler av invasion, replikation och merozoitfrisättning resulterar i en exponentiell tillväxt av parasitpopulationen och utlöser slutligen sjukdomssymtom².

En viktig utmaning för att studera immunsvaret mot malaria är att Plasmodium spp. som infekterar människor inte infekterar laboratoriedjurmodeller. Således måste Plasmodium-infekterade patientprover samlas in färskt och omedelbart bearbetas och analyseras. Men i malaria-endemiska områden är resurserna för att få tillgång till immunologiska och molekylära mekanismer begränsade. På grund av dessa begränsningar används gnagare ofta som experimentella modeller för att undersöka immunsvaret mot Plasmodium-infektion. Medan P. berghei och P. chabaudi ofta används som surrogat för P. falciparum-infektion, har den icke-dödliga stammen av P. yoelii 17XNL också många gemensamma drag med P. vivax, såsom retikulocytbegränsad infektion ^3,4. Utvecklingen av Plasmodium in vitro-analyser, som kan användas för prover från humana eller djurmodeller, är värdefull för att få en bättre förståelse för patogenesen av malaria och jämföra det immunologiska svaret som framkallas av olika arter av parasiten.

Skyddande antimalarial immunitet är inte fullständigt förstådd varken vid pre-erytrocytiskt stadium eller blodstadiet. Det är känt att exponering för upprepade infektioner resulterar i partiell förvärvad immunitet, men steril immunitet utvecklas sällan⁵. I årtionden var anti-Plasmodium skyddande immunitet huvudsakligen associerad med induktion av neutraliserande eller opsoniserande antikroppar som förhindrar parasitinvasion av värdceller eller leder till fagocytos av antigenpresenterande celler, respektive⁶. Som ett resultat har de flesta ansträngningar för att producera antimalariala vacciner hittills förlitat sig på att inducera skyddande och långvariga antikroppar ^7,8. Det sterila skydd som induceras genom vaccination med en försvagad sporozoit korrelerar emellertid direkt med aktiveringen och expansionen av cytotoxiska T-lymfocyter ^8,9.

Nyligen har vissa studier av nyligen isolerade patientprover och in vitro-kulturer visat att medfödda eller adaptiva cytotoxiska immunceller som CD8 ⁺ T 10, γδ T¹¹ och NK-celler¹² direkt kan eliminera Plasmodium-infekterade RBC och dess intracellulära parasit på ett effektor: målförhållande sätt. Dessa banbrytande fynd definierade en helt ny immuneffektormekanism i samband med malaria. För att dissekera denna nya antimalariala immunitet är det viktigt att utforska cytotoxiska effektormekanismer hos mördarceller mot infekterade RBC (iRBC) vid naturlig infektion eller vaccination.

Här presenterar vi en in vitro-analys som mäter lymfocyternas cytotoxiska aktivitet mot malaria i blodstadiet. Denna analys kan sedan hjälpa till att belysa mekanismerna för det cellulära immunsvaret mot Plasmodium erytrocytstadiet. Målcellerna, iRBCs, märks med karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE) för att utvärdera cellviabiliteten och samodlas sedan med effektorceller som cytotoxiska lymfocyter (CTL). Denna samodling utvärderas sedan med flödescytometri med hjälp av fluorescerande markörer för specifika celltyper. Slutligen beräknas procentandelen iRBC-lys med CTL genom att dividera det experimentella tillståndet med spontan bristning av RBC och spontanlyskontroll, som inträffar under inkubation utan effektorcellen. Sammantaget kan denna dödande analysmetod bidra till en bättre förståelse av cellmedierad malariaimmunitet.

Protocol

Alla procedurer genomfördes enligt policyerna från Oswaldo Cruz Foundation och National Ethical Council (CAAE: 59902816.7.0000.5091). De mänskliga protokollen utvecklades i samarbete med den kliniska forskargruppen från Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM), som ansvarade för att inkludera patienter i studien. Informerat samtycke erhölls från alla patienter. För djurstudien utfördes procedurer enligt principerna för uppförande av den brasilianska praxisguiden f?…

Representative Results

Här beskrivs den tillämpade metoden för isolering av CFSE-märkta Plasmodium-infekterade RBC i en samodlingsanalys med cytotoxiska lymfocyter. Först tillhandahåller vi en schematisk representation av hur man utför protokollet, med hjälp av humana prover infekterade med P. vivax (figur 1). Därefter ett illustrerat flödesschema om hur man går vidare med protokollet i en malariaexperimentell modell med hjälp av en C57BL / 6-mus infekterad med P. yoelii (<st…

Discussion

Här beskriver vi en in vitro-analys för att mäta Plasmodium-infekterade röda blodkroppar dödande av cytotoxiska lymfocyter. Denna analys kan hjälpa till att belysa mekanismerna för cellulär skyddande immunitet mot malariaparasitens erytrocytiska stadium. Den stora fördelen med denna metod är att den ger en kvantitativ analys av cellmedierad avdödning av iRBC som kan användas för att ta itu med många frågor om hur immunceller interagerar med olika Plasmodium spp.

<p class="jov…

Materials

100 μM cell strainer	Corning	431752
96 Well Round (U) Bottom Plate	Thermo Scientific	12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody	Biolegend	349114	Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317314	Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody	Biolegend	344714	Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody	Biolegend	331408	Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100733	Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody	Biolegend	116223	Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	26140079
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP	meithel pharma	71228-400-003	Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane	Piramal critical care	66794-0013-25
LS MACS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Bioscience
Percoll	Cytiva	17089101	Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;	BD	14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml	BD	366480