In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten
Summary
Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.
Abstract
Malaria is een groot probleem voor de volksgezondheid en presenteert wereldwijd meer dan 200 miljoen gevallen per jaar. Ondanks jarenlange wetenschappelijke inspanningen is beschermende immuniteit tegen malaria nog steeds slecht begrepen, voornamelijk als gevolg van methodologische beperkingen van langdurige Plasmodium-cultuur, vooral voor Plasmodium vivax. De meeste studies hebben zich gericht op adaptieve immuniteitsbescherming tegen malaria door antilichamen, die een sleutelrol spelen bij het beheersen van malaria. De steriele bescherming geïnduceerd door verzwakte Plasmodium sporozoïetenvaccins is echter gerelateerd aan cellulaire respons, voornamelijk op cytotoxische T-lymfocyten, zoals CD8 + en gamma delta T-cellen (γδ T). Daarom moeten nieuwe methodologieën worden ontwikkeld om de functies van de cellulaire immuunrespons beter te begrijpen en zo toekomstige therapie en vaccinontwikkeling te ondersteunen. Om een nieuwe strategie te vinden om deze celgemedieerde immuniteit tegen Plasmodium bloedstadium-infectie te analyseren, heeft onze groep een in vitro test opgezet die geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBC) doding door cytotoxische lymfocyten meet. Deze test kan worden gebruikt om cellulaire immuunresponsmechanismen tegen verschillende Plasmodium spp. in het bloedstadium te bestuderen. Aangeboren en adaptieve cytotoxische immuuncellen kunnen iRBC’s en de intracellulaire parasiet direct elimineren in een effector:target-mechanisme. Doel-iRBC’s worden gelabeld om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren en gecocultiveerd met effectorcellen (CD8 + T, γδ T, NK-cellen, enz.). Het lysispercentage wordt berekend op basis van geteste omstandigheden, vergeleken met een spontane lysiscontrole in een op flowcytometrie gebaseerde assay. Uiteindelijk is deze moordtestmethode een belangrijke vooruitgang in het begrijpen van celgemedieerde immuniteit tegen malaria in het bloedstadium, waardoor nieuwe potentiële therapeutische doelen worden ontdekt en de ontwikkeling van malariavaccins wordt versneld.
Introduction
Malaria blijft een wereldwijde gezondheidscrisis, met meer dan 240 miljoen gevallen en 627.000 malariagerelateerde sterfgevallen gemeld in 20201. Er zijn momenteel vijf parasitaire soorten die malaria bij de mens kunnen veroorzaken, waarvan Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax de twee meest voorkomende soorten zijn. Tijdens Plasmodium-infectie is de lever of het pre-erytrocytische stadium asymptomatisch en treden de symptomen alleen op tijdens de aseksuele cyclus van de parasiet in het erytrocytische stadium. In dit infectiestadium worden duizenden merozoïeten afgeleid van het leverstadium vrijgegeven in de bloedbaan en infecteren rode bloedcellen (RBC’s). In de RBC differentiëren de parasieten in trofozoïeten en schizonten door schizogonie, totdat schizonten de erytrocyt scheuren, nieuw gevormde merozoieten vrijgeven en deze bloedcyclus herhalen. Herhaalde cycli van invasie, replicatie en merozoïetafgifte resulteren in een exponentiële groei van de parasietpopulatie en veroorzaken uiteindelijk ziektesymptomen2.
Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van de immuunrespons op malaria is dat de Plasmodium spp. die mensen infecteert, infecteert geen proefdiermodellen. Plasmodium-geïnfecteerde patiëntmonsters moeten dus vers worden verzameld en onmiddellijk worden verwerkt en geanalyseerd. In malaria-endemische gebieden zijn de middelen om toegang te krijgen tot immunologische en moleculaire mechanismen echter beperkt. Vanwege deze beperkingen worden knaagdieren veel gebruikt als experimentele modellen om de immuunrespons tegen Plasmodium-infectie te onderzoeken. Hoewel P. berghei en P. chabaudi vaak worden gebruikt als surrogaten voor P. falciparum-infectie, heeft de niet-dodelijke stam van P. yoelii 17XNL ook veel kenmerken gemeen met P. vivax, zoals reticulocytenbeperkte infectie 3,4. De ontwikkeling van Plasmodium in vitro assays, die kunnen worden gebruikt voor van menselijke of dierlijke modellen afgeleide monsters, is waardevol voor het verkrijgen van een beter begrip van de pathogenese van malaria en het vergelijken van de immunologische respons die wordt opgewekt door verschillende soorten van de parasiet.
Beschermende antimalaria-immuniteit wordt niet volledig begrepen, noch in het pre-erytrocytische stadium, noch in het bloedstadium. Het is bekend dat blootstelling aan herhaalde infecties resulteert in gedeeltelijk verworven immuniteit, maar steriele immuniteit wordt zelden ontwikkeld5. Decennialang werd anti-Plasmodium beschermende immuniteit voornamelijk geassocieerd met de inductie van neutraliserende of opsoniserende antilichamen die parasitaire invasie van gastheercellen voorkomen of leiden tot fagocytose door antigeen-presenterende cellen, respectievelijk6. Als gevolg hiervan zijn de meeste inspanningen om antimalariavaccins te produceren tot nu toe gebaseerd op het induceren van beschermende en langdurige antilichamen 7,8. De steriele bescherming geïnduceerd door vaccinatie met een verzwakt sporozoiet correleert echter direct met de activering en expansie van cytotoxische T-lymfocyten 8,9.
Onlangs hebben sommige studies van vers geïsoleerde patiëntmonsters en in vitro culturen aangetoond dat aangeboren of adaptieve cytotoxische immuuncellen zoals CD8 + T 10, γδ T11 en NK-cellen12 plasmodium-geïnfecteerde RBC’s en zijn intracellulaire parasiet direct kunnen elimineren op een effector: target ratio manier. Deze baanbrekende bevindingen definieerden een geheel nieuw immuuneffectormechanisme in de context van malaria. Om deze nieuwe antimalaria-immuniteit te ontleden, is het essentieel om cytotoxische effectormechanismen van killercellen tegen geïnfecteerde RBC’s (iRBC’s) bij natuurlijke infectie of vaccinatie te onderzoeken.
Hier presenteren we een in vitro test die de cytotoxische activiteit van lymfocyten tegen malaria in het bloedstadium meet. Deze test kan vervolgens helpen bij het ophelderen van de mechanismen van de cellulaire immuunrespons tegen het Plasmodium erytrocytenstadium. De doelcellen, iRBC’s, worden gelabeld met carboxyfluoresceïnesuccinimidylester (CFSE) om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren en worden vervolgens gecocultiveerd met effectorcellen zoals cytotoxische lymfocyten (CTL). Deze cocultuur wordt vervolgens geëvalueerd door flowcytometrie, met behulp van fluorescerende markers voor specifieke celtypen. Ten slotte wordt het percentage iRBC-lysis door CTL berekend door de experimentele toestand te delen door de spontane breuk van RBC’s en spontane lysiscontrole, die optreedt tijdens incubatie zonder de effectorcel. Over het algemeen kan deze dodingstestmethode bijdragen aan een beter begrip van celgemedieerde malaria-immuniteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een in vitro test om plasmodium-geïnfecteerde rode bloedcellen te doden door cytotoxische lymfocyten. Deze test kan helpen bij het ophelderen van de mechanismen van cellulaire beschermende immuniteit tegen het erytrocytische stadium van de malariaparasiet. Het grote voordeel van deze methodologie is dat het een kwantitatieve test biedt van het celgemedieerde doden van iRBC’s die kan worden gebruikt om veel vragen te beantwoorden over hoe immuuncellen interageren met verschillende <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Dr. Dhelio Pereira en de leden van het Onderzoekscentrum voor Tropische Geneeskunde van Rondônia (CEPEM) voor de inschrijving van malariapatiënten en bloedafname en Felicia Ho voor het helpen met de herziening van het manuscript. Het volgende reagens werd verkregen via BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, bijgedragen door Ana Rodriguez. Dit onderzoek werd ondersteund door Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, fellowships (CJ, GC, CG), en Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – fellowship (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
